XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

Введение

Особенные оптические свойства квантовых точек (КТ) делают их перспективным материалом для применения в самых различных областях. В частности, ведутся разработки по использованию КТ в светоизлучающих диодах, дисплеях, лазерах, солнечных батареях.

Конъюгация КТ с антителами может быть достигнута в результате адсорбции [1, 2], комплексообразования [3, 4], или за счет образования ковалентной связи [5,6,7], между группами лигандов, покрывающих КТ, и функциональными группами биомолекул. В таком виде они применяются в качестве флуоресцентных меток в самых разных приложениях биоанализа – от иммунохимических тест-методов до визуализации тканей и отслеживания лекарственных веществ в организме. Уникальные характеристики, такие как зависимость цвета флуоресценции от размера, высокая фотостабильность, широкие спектры поглощения, делают КТ идеальными флуорофорами для сверхчувствительной, многоцветной детекции биологических объектов и медицинской диагностики.

Таким образом, применение КТ в биоанализе на сегодняшний день является одной из перспективных областей применения люминесцирующих нанокристаллов.

Целью работы является исследование конъюгации гидрофильных КТ с антителами.

Экспериментальная часть

Очистка антител от сульфата аммония

Антитела хранятся под 50% раствором сульфата аммония. Перед использованием антитела очищают от сульфата аммония. Берут 400 мкл антител добавляют в ультрацентрифужные фильтры Amicon и центрифугируют при g = 11,000 в течении 7 минут, используя в качестве противовеса воду и повторяют процедуру 2 раза.

Получение конъюгата КТ с антителами

Синтез проводят в 0.01 М натрий–фосфатном буфере (PBS) с рН = 7,8

Активируют в пробирке функциональные группы КТ. Для этого к 413.5 мкл КТ добавляют 16,54 мкл EDC и 8, 27 мкл NHS

Оставляют активироваться на 15 минут. Далее подготавливают пробирку с уже очищенными антителами и смешивают с активированными КТ. Оставляют на 1,5 часа в темноте при постоянном перемешивании.

В полученном растворе блокируют несвязавшиеся антитела, для этого добавляют блокирующий раствор.После этого конъюгат концентрируют в ультрацентрифужных пробирках Amicon, заливают к конъюгатам 1 мл 0,01 М PBS и концентрируют до 100 мкл (скорость 1100 rpm, 10- 15 минут).

Для повышения уровня специфического взаимодействия конъюгата КТ-антитело и снижения предела обнаружения антигена требуется очистка синтезированного иммунореагента от не связавшихся антител и наночастиц. В данной работе использовался способ очистки, реализованный пропусканием реакционной смеси через колонку, заполненную Superose 6. При гельфильтрационном разделении реакционной смеси конъюгат КТ с антителами выходит в первых фракциях, поэтому продукт синтеза собирается с момента появления окрашенного элюата, а заканчивается тогда, когда элюат становится визуально прозрачным.

Для начала superpose 6 очищают следующим образом: промывают 0.5 M соляной кислотой HCl, далее H₂O до нейтральной рН фильтрата, затем 3% триэтиламином, и в конечном счете 0,01 М PBS с pH =7,8.

Перед очисткой конъюгата фиксируют колонку на штативе, заполняют superose 6. Колонка представляет собой пипетку на 10 мл. Прокачивают с помощью шприца
0,01 М PBS через superpose 6. Далее аккуратно наливают с помощью пипетки сконцентрированный конъюгат и прогоняют по колонке с помощью шприца. Затем собирают конъюгат (окрашенную часть) в ультрацентрифужные пробирки Amicon и концентрируют (скорость 11000 rpm, 10­–15 минут). После последнего этапа центрифугирования конъюгат, сконцентрированный в 10 раз, собирали в микропробирку и хранили при 4 ºС.

Тестирование конъюгатов на иммунохроматографической системе.

Тест-полоску берут только за впитывающую зону. Рабочее место обязательно протереть спиртом. В качестве антигена используется лизат (PRV-k) . В качестве элюента применяется 0,01 М PBS рН=7,8. В буфере разводят лизат в соотношении 1:100 (200 мкл 0,01М PBS и 2 мкл лизата) , 1: 400 (150 мкл 1xPBS 50мкл лизата) достаточном для окрашивания тестовой линии. На тест-полоску наносят 10 мкл раствора конъюгата. Далее наносят элюент с антигеном объемом 50 мкл. Когда элюент проходит всю аналитическую зону, добавляют еще 50 мкл элюента. Через 20 минут по завершению элюирования интерпретируют результат теста.

Обсуждение результатов

В данной работе используется ковалентная пришивка антител, исходные КТ CdTeSe/CdS/CdZnS/ZnS подвергались модификации с образованием на их поверхности карбоксильных групп при помощи EDC и NHS. Пришивка белков к карбоксильным группам осуществляется в мягких условиях карбоимидным методом с образованием ковалентной связи. Важно получить жестко закрепленные на КТ антитела, чтобы не происходила диссоциация коньюгата КТ и антитела и не размывались по поверхности мембраны.

Предложенный метод определения гликопротеина gB основан на «сэндвич»–формате иммуноанализа. Содержащиеся в образце молекулы гликопротеина gB связываются с антителами, меченными КТ. Под действием капиллярных сил сформировавшийся комплекс движется вдоль мембран тест-полоски и взаимодействует с адсорбированными в тестовой зоне антителами против гликопротеина gB.

Наличие второй окрашенной полоски говорит о работоспособности теста, наиболее четкое окрашивание видно при УФ - излучении (Рис. 1).

Рисунок 1 — Вид тест-полоски контрольной зоны (слева), с анализируемым образцом (справа) при УФ – излучении.

На спектрофотометре (СПЕКС ССП -715) было снято два спектра, первый (красный) — конъюгат на фоне буфера, второй (синий) — КТ на фоне воды, полученные данные интерпретировали в Excel построили график (Рис. 2).

Рисунок 2 — Спектры поглощения КТ и конъюгата

На спектре наблюдается поглощение на длине волны 550-560 нм имеется плечо, которое соответствует минимуму энергии, необходимой для образования экситонов. При использовании известных коэффициентов экстинкции можно определить концентрацию КТ в исследуемом растворе по закону светопоглощения (закон Бугера ­– Ламберта – Бера). Оценивая положение экситонного пика, согласно литературным данным [8], можно оценить средний размер КТ. Определенный средний размер ядер составил 2,3 нм.

П осле проведения конъюгации образцы исследовали флуоресцентным методом анализа (Рис.3,4).

Рисунок 3 — Зависимость флуоресценции КТ от концентрации.

Рисунок 4 — Зависимость флуоресценции конъюгата КТ-Ат от концентрации

Поведение зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации немонотонно. При увеличении концентрации от 0.00125 мкМ до 0.08 мкМ интенсивность пиков при длине волны 700 нм возрастает, а затем убывает. Уменьшение интенсивности флуоресценции при увеличении концентрации относится к группе эффектов, называемых концентрационным тушением. При увеличении концентрации увеличивается число центров тушения, связанных с собственными дефектами [9, 10].

Заключение:

Выбран наиболее подходящий метод синтеза конъюгатов КТ с антителами.

Проведен синтез конъюгатов квантовых точек с моноклональными антителами для иммунохроматографического анализа.

С помощью спектрофотометрических методов анализа (спектры поглощения и флуорисценции) исследованы свойства полученных конъюгатов КТ с антителами.

Список использованной литературы

Шипунова В. О. Многофункциональные надмолекулярные комплексы для контролируемого воздействия на клетки in vitro и in vivo. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. 2016.

Малышева Н. Н. Разработка иммуносенсора для определения антигена вируса кори с использованием нанокомпозитов на основе Fe₃O₄. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. 2015

Lao U. L., Mulchandani A., Chen W. Simple conjugation and purification of quantum dot− antibody complexes using a thermally responsive elastin-protein l scaffold as immunofluorescent agents //Journal of the American Chemical Society. – 2006. – V. 128. – №. 46. – P. 14756-14757.

Pathak S., Davidson M. C., Silva G. A. Characterization of the functional binding properties of antibody conjugated quantum dots //Nano Letters. – 2007. – V. 7. – №. 7. – P. 1839-1845.

Mahtab R., Harden H. H., Murphy C. J. Temperature-and Salt-Dependent Binding of Long DNA to Protein-Sized Quantum Dots: Thermodynamics of “Inorganic Protein”− DNA Interactions // Journal of the American Chemical Society. – 2000. – V. 122. – №. 1. – P. 14-17.

Torchynska T. V. Interface states and bio-conjugation of CdSe/ZnS core – shell quantum dots //Nanotechnology. – 2009. – V. 20. – №. 9. – P. 95 – 401.

Foubert A. et al. Bioconjugation of quantum dots: Review and impact on future application //TrAC Trends in Analytical Chemistry. – 2016. – V. 83. – P.31– 48.

Таранова Н. А. Комплексы антител с нанодисперсными носителями: синтез, свойства и применение в иммунохроматографии. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. 2014.

Byzova N. A. et al. Pretreatment-free immunochromatographic assay for the detection of streptomycin and its application to the control of milk and dairy products //Analytica chimica acta. – 2011. – V. 701. – №. 2. – P. 209-217.

Тест-система для полуколичественного иммунохроматографического анализа: пат. 2510510 РФ // Андреева И.П., Григоренко В.Г., Кондаков С.Э., Осипов А.П. Публ.: 27.03.2014.

Код для цитирования: Скопировать