XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

В настоящее время для решения многих задач в медицинской диагностике широко используются иммунохимические методы анализа. При этом в качестве меток чаще всего используются коллоидные частицы металлов, обладающие уникальными оптическими и физико-химическими свойствами из-за своих размеров.

Работу выполняли на жидкостном хроматографе LC-20 фирмы «Shimadzu» с диодно-матричным детектором SPD-M20 A. Объектами исследования являлись квантовые точки, моноклональные антитела к гликопротеину gB вируса болезни Ауески и их конъюгаты.

Определение аналитов проводили методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Выбраны условия, при которых наблюдается высокая селективность и эффективность разделения объектов исследования.

При проведении анализа методом эксклюзионной хроматографии, анализ проводили в изократическом режиме с подвижной фазой состава фосфатный буферный раствор рН=7 – вода, в соотношении 50:50, скорость движения подвижной фазы 1 мл/мин, объем инжекции 5 мкл и температурой колонки 25 °С. Показано, что в этих условиях достигается хорошее разрешение пиков анализируемых соединений, что позволяет проводить их анализ в смеси.

Метод эксклюзионной хроматографии проведен нами для оценки размеров аналитов и исследования агрегации белковых молекул. Эксклюзионная хроматография – это метод разделения белковых молекул в соответствии с их размером. В отличие от других видов хроматографии, в данном методе отсутствует взаимодействие анализируемого вещества с материалом НФ колонки. Благодаря этому обеспечивается идеальное разделение и исследование белков, которые содержат агрегаты, вспомогательные вещества и другие загрязнения, образующиеся при деградации белков. По этой причине эксклюзионная хроматография широко используется для характеризации биомолекул.

Порядок элюирования зависит от размеров молекул в растворе, но есть ряд нюансов. Большинство белков имеют компактную форму молекул, но некоторые из них имеют цилиндрическую форму и вследствие этого больший гидродинамический радиус в растворе и поэтому элюируются раньше, чем ожидается (рисунок 1).

Рис. 1 - Сравнение компактной и цилиндрической формы глобулярного белка

Более того, различные подвижные фазы могут способствовать изменению формы молекул в растворе (гидродинамического радиуса или радиуса инерции), что приводит к изменению порядка элюирования.

Пробоподготовка для эксклюзионной хроматографии такая же, как для ВЭЖХ белков. Наиболее важным аспектом является растворимость пробы в элюенте и в подвижной фазе. По сравнению с другими видами ВЭЖХ вследствие больших размеров колонки и низкой линейной скорости из-за относительно низких скоростей потока может понадобиться увеличение концентрации проб и объемов вводов. Для защиты колонки от разрушения перед анализом рекомендуется фильтровать или центрифугировать пробы, чтобы удалить из них микрочастицы. Однако для проб с низкой растворимостью фильтрация не подходит. Для таких проб необходимо подобрать другой растворитель.

Качественная пробоподготовка предполагает проверку того, что при растворении пробы по выбранной методике не изменяются ее свойства. В условиях различного воздействия некоторые белки могут агрегировать (образовывать димеры или мультимеры с более высокой молекулярной массой) или распадаться (образовывать элементы с более низкой молекулярной массой). Такие воздействия могут включать замораживание и оттаивание, экстремальные температуры, ультразвук или даже изменение концентрации.

При проведении анализа по методу эксклюзионной хроматографии чрезвычайно важным показателем является объем элюции (или время удерживания). В данном методе в качестве подвижной фазы обычно используется свежеприготовленный буферный раствор. В качестве ПФ был выбран фосфатный буфер с рН = 7. Хроматографирование проводили в изократическом режиме на колонке ZORBAX GF-250 фирмы Agilent с гидрофильной диольной привитой фазой на основе диоксидов циркония и кремния. Однако при этом время анализа было велико и даже в течение 40 минут вещества не элюировались с колонки. Увеличить элюирующую силу в эксклюзионной хроматографии можно уменьшая ионную силу. Поэтому для сокращения времени выхода реагентов концентрацию буферного раствора уменьшили в 2 раза. Полученные хроматограммы представлены на рисунках 2-4.

Рис.2 Хроматограмма водного раствора квантовых точек, c=1,6∙10^-4;

ПФ ФБ: H₂O =50:50, изократический режим элюирования;

объем инжекции 5 мкл; скорость потока – 1 мл/мин

Рис. 3 - Хроматограмма раствора конъюгата в фосфатном буфере (1хPBS),

c=5,6∙10^-4;ПФ ФБ: H₂O =50:50 изократический режим элюирования;

объем инжекции 5 мкл; скорость потока – 1 мл/мин

Рис. 4 - Хроматограмма раствора моноклональных антител в фосфатном буфере (1хPBS):

c=5,6 10^-4;ПФ ФБ: H₂O =50:50 изократический режим элюирования;

объем инжекции 5 мкл; скорость потока – 1 мл/мин

Хроматографические параметры для КТ, моноклональных антител и конъюгата в условиях изократического режима элюирования при объеме инжекции 5 мкл и скорости потока 1 мл/мин были рассчитаны по формулам 1-4 и их значения представлены в таблице 1.

Табл.1– Хроматографические параметры в выбранных условиях хроматографирования

Из данных, приведенных в таблице видно, что в выбранных условиях достигается хорошее разрешение пиков, значения коэффициентов емкости kʹ для всех пиков находятся в оптимальном диапазоне. Эффективность хроматографической колонки (N) для исследуемых компонентов высока. Однако, время удерживания конъюгата, который представляет собой сшитые антитело и КТ, больше времени удерживания моноклональных антител в отличие от предполагаемого. Данное обстоятельство можно объяснить либо образованием ассоциата, либо изменением конформации белковой части конъюгата.