X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Казеин является главным белком молока всех млекопитающих, основной белковой группой коровьего молока. Относится к белковому запасу, принадлежит к фракции белков, называемых фосфопротеидами. Один из наиболее ценных пищевых белков, содержащий все незаменимые аминокислоты. Содержание его в коровьем молоке примерно 80% (~78-87%) от всех белков. Основными компонентами казеина являются α s1- , β-, χ-, γ-казеин. Казеины α и β-наиболее чувствительные к ионам Ca, γ-казеин ионами Ca не осаждается, однако γ-казеин содержит чувствительную к сычужному ферменту пептидную связь, образованную остатками фенилаланина и метионина. Казеин, как и любой другой белок, распадается при термической обработке, однако он гораздо более термоустойчив. Для его разрушения необходимо температурное воздействие в 130 градусов Цельсия. Также, казеин образован из большого числа различных аминокислот, объединенных друг с другом в полипептидной цепи, но содержит также множество фосфатных групп, которые и связывают кальций (казеинат кальция, соль кальция)

В молоке казеин находится не в свободном виде, а в виде казеинаткальцийфосфатного комплекса – ККФК. Казеинаткальцийфосфатный комплекс образует мицеллы сферической формы, состоящие из субмицелл. Нативные мицеллы казеина имеют на поверхности общий отрицательный заряд и прочную гидратную оболочку, что в заметной степени обусловливает их устойчивость в молоке. Такой вид казеина иногда именуется как казеиноген.

При прокисании молоко сворачивается, и казеин осаждается в форме творожного сгустка. Свёртывание казеина в молоке протекает под влиянием протеолитических ферментов сычужного сока, кислот, вырабатываемых молочнокислыми бактериями, либо при прямой добавке кислот (технический казеин).

Казеин получают разными способами. Важный фактор, определяющий промышленное получение казеина, является его растворимость в различных растворах. Казеин растворим в разбавленных растворах щелочей и в сильных кислотах, однако нерастворим в разбавленных кислотах, где он выпадает в осадок. Для производства казеина применяется свежее обезжиренное молоко. Удаление жира в молоке происходит с помощью центрифугирования, после чего в него добавляют слабощелочной раствор. Для отделения малейших следов жира снова центрифугируют и приливают разбавленный раствор кислоты, чтобы добиться максимально полного выпадения казеина в осадок. Образовавшийся творожный сгусток промывают для удаления кислоты и высушивают при низкой температуре, поскольку казеин чувствителен к нагреванию.

Существуют четыре основных метода определения массовой доли белка в молоке и молочных продуктах:

– Метод Кьельдаля

– Рефрактометрический метод

– Колориметрический метод

– Метод формольного титрования

ГОСТ 25179-2014 устанавливает методы определения массовой доли белка в колориметрическом методе и в методе формольного титрования. ГОСТ 53951-2010, а так же ГОСТ 23327-98 регулируют измерение массовой доли белка по Кьельдалю.

Метод Кьельдаля

Данный метод основывается на сжигании органических компонентов молочной пробы в колбе Кьельдаля с добавлением серной кислоты в присутствии катализатора сульфата меди. Определяют массовую долю азота, который в ходе реакции освобождается. Массовую долю белка находят, умножая полученный результат на соответствующий коэффициент.

Массовую долю азота определяют следующими способами:

Электрохимический.Кулонометрическое титрование аммиака происходит автоматически в минерализованной пробе.

Химический. Раствор подщелачивается, аммиак с водяным паром дистиллируется, с поглощением его раствором борной кислоты и титрованием последнего раствором соляной кислоты. Индикация точки эквивалентности происходит по изменению окраски индикатора или с помощью потенциометрического анализатора.

Измерения проводится с добавлением, в колбу Кьельдаля, нескольких кусочков фарфора, примерно 10 г. сульфата калия, 0,04 г. сульфата меди. Молочную пробу отмеривают в бюксу с крышкой в количестве 5 см³, крышку закрывают и взвешивают. Перелив молоко из бюксы в колбу, пустую бюксу взвешивают и по разнице определяют массу взятого молока. В колбу с молоком осторожно по стеночкам, тем самым смывая молоко со стенок колбы, добавляют 20 см³ серной кислоты. Колбу закрывают, содержимое с осторожностью перемешивают.

Колбу устанавливают на нагревательный прибор под углом в 45º и осторожно, нагревают до тех пор, пока не прекратится бурное вспенивание и содержимое колбы не станет жидким. Далее процесс продолжают при более интенсивном нагревании. Кипящая кислота должна конденсироваться в середине горловины колбы Кьельдаля. Степень нагревания считается достаточной, когда жидкость становится прозрачной, бесцветной (при применении в качестве катализатора окиси ртути) или слегка голубоватой (при применении в качестве катализатора сульфата меди).

Как только раствор обесцветится, нагревание следует продолжать в течение 1,5 часа. После чего колбе необходимо дать остыть до комнатной температуры. Как только температура достигнет комнатной, доливают 150 см³ дистиллированной воды и вносят несколько кусочков свежепрокаленной пемзы, перемешивают, и снова остужают.

В коническую колбу отмеривают 50 см³ раствора борной кислоты, добавляют 4 капли индикатора и перемешивают.

Собирают установку:

Коническую колбу с борной кислотой устанавливают под холодильником, и соединяют при помощи аллонжа и резиновой трубки, при условии ,что конец аллонжа должен быть погружен в кислоту. Колбу Кьельдаля соединяют с холодильником при помощи каплеуловителя, проходящего через одну пробку с делительной воронкой. Отмеряют 80 см³ раствора гидроксида натрия и приливают его через делительную воронку в колбу Кьельдаля. Кран делительной воронки закрывают незамедлительно для избегания потери образующегося аммиака. Содержимое колбы Кьельдаля круговыми движениями осторожно смешивают и доводят до кипения. Пенообразования следует избегать.

В холодильнике происходит конденсация паров раствора аммиака, которые попадают в колбу с раствором борной кислоты. Перегонка продолжается пока жидкость не начнет бурлить. Степень нагрева регулируется так, чтобы время дистилляции было не менее 20 минут. Борная кислота в процессе принимает зеленую окраску. Полнота перегонки аммиака проверяется путем дополнительной перегонки в новую порцию борной кислоты (20 см³) в течение 5 минут. Окраска раствора борной кислоты не должна меняться. При перегонке не допускается нагревания раствора борной кислоты. Слишком сильное охлаждение (как правило, ниже 10ºС) недопустимо, оно может вызвать переход жидкости из конической колбы в колбу Кьельдаля. По окончании перегонки аллонж вынимают из раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2 минут. После прекращения нагревания отсоединяют аллонж. Поверхности аллонжа промываются небольшим количеством дистиллированной воды, сливая ее в коническую колбу. Дистиллят титруют раствором соляной кислоты до перехода зеленого цвета в серый. При избытке титранта раствор приобретает фиолетовый цвет.

Параллельно основному проводят контрольный опыт, применяя 5 см³ дистиллированной воды вместо молочной пробы. Контрольный опыт необходимо повторить не менее 5 раз. По объему аммиака, определяемого титрованием, устанавливают количество общего азота. При умножении количества азота на принятый коэффициент 6,38 для молока; 6,25 для молокосодержащих продуктов; 6,28 для сыворотки, таким образом, находят содержание общего белка в молоке.

Колориметрический метод.

Метод основывается на способности белков молока связывать кислый краситель (при рН ниже изоэлектрической точки), образуя с ним нерастворимый осадок, удаляя который измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора.

В пробирку отмеряют 1 см³ молока, приливают 20 см³ рабочего раствора сине-черного красителя, который готовится путем смешивания водного раствора красителя и кислого буферного раствора с добавлением поверхностно-активного вещества (ПАВ). Пробирку закрывают и получившуюся смесь интенсивно перемешивают. Встряхивание не допускается во избежание появления трудноразрушаемой пены. Выпавший осадок центрифугируют 10 минут при 1500 об./мин (20 минут при меньшей частоте вращения в 1000 об./мин.) Далее необходимо отобрать 1 см³ надосадочной жидкости и перенести в мерную колбу №1. Дистиллированной водой доливают до метки 50 см³ и перемешивают. В мерную колбу №2 помещают 1 см³ красителя и так же доливают дистиллированной водой до метки 50 см³. Используя колориметр или спектрофотометр, измеряют оптическую плотность разбавленного раствора красителя (колба №2) по отношению к анализируемой пробе (колба №1). После каждых 24х измерений кювету промывают, специально приготовленным по ГОСТу, буферным раствором.

Массовую долю белка Х4, %, вычисляют по формуле:

Х4 =7,78D - 1,34

где 7,78 - эмпирический коэффициент, %/ед. оптической плотности;

D - измеренная оптическая плотность, ед. оптической плотности;

1,34 - эмпирический коэффициент, %.

Окончательный результат есть среднеарифметическое значение результатов измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака.

Метод формольного титрования.

Этот метод основывается на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых кислот белков раствором гидроксида натрия. Количество гидроксида натрия, затраченного на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке.

В стакан помещают стержень магнитной мешалки и вносят 20 см³ молочной пробы. Далее стакан устанавливается на магнитной мешалке, двигатель мешалки запускают и в молочную пробу погружают электроды потенциометрического анализатора. Постепенно приливают раствор гидроокиси натрия. При достижении точки эквивалентности (pH = 9, подавая раствор по каплям начиная с рН = 4) и окончании времени выдержки, которая длится 30 сек., определяют количество раствора гидроокиси натрия, израсходованное на нейтрализацию молочной пробы до внесения формальдегида. После в стакан вносят 5 см³ формальдегида и засекают время. Через 2 — 2,5 мин. продолжают титрование (снова до точки эквивалентности, где рН=9) и по окончании процесса определяют общее количество раствора, использованного для нейтрализации.

Параллельно основному проводится контрольный опыт по нейтрализации смеси 20 см³ воды и 5 см³ раствора формальдегида.

Массовую долю белка Х₃, %, вычисляют по формуле:

Х₃ = (V₂ – V₁ – V₀)^. 0,96 + K

V₂– общее количество раствора, израсходованное на нейтрализацию;

V₁– количество раствора, израсходованное на нейтрализацию до внесения формальдегида;

V₀ – количество раствора, израсходованное на контрольный опыт;

0,96 – эмпирический коэффициент;

K – поправка к результату измерения массовой доли белка, %.

Окончательный результат есть среднеарифметическое значение результатов измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака.

Рефрактометрический метод

Метод основывается на измерении разности показателей преломления луча света, после прохождения его через молоко и безбелковую молочную сыворотку, полученную из той же молочной пробы. Разность между ними прямо пропорциональна массовой доле белка в молоке.

Навеску 40,0 г хлористого кальция вносят в колбу вместимостью 1000 см³, сюда же добавляют 500 см³ воды и перемешивают до полного растворения осадка. Содержимое колбы нагревают до температуры 20^оС и доводят дистиллированной водой до метки.

Наливают в 3 флакона по 5 см³ молока, вносят по 6 капель 4%-ного раствора хлористого кальция. Закрывают флаконы пробками, и их содержимое перемешивают, переворачивая флаконы. Далее флаконы помещают в водяную баню, при этом уровень воды в бане должен достигать половины высоты флаконов. Баню закрывают, ставят на электроплитку, доводят содержимое бани до кипения и продолжают кипятить как минимум 10 мин. Сливают горячую воду через отверстия на крышке, не открывая бани, добавляют в баню холодную воду и держат в ней как минимум 2 мин.

Через время баню открывают, достают флаконы и разрушают белковый сгусток, энергично встряхивая флаконы. Флаконы устанавливают в центрифугу и центрифугируют как минимум 10 мин. Получившуюся прозрачную сыворотку отбирают пипеткой и капают на измерительную призму рефрактометра 1-2 капли. Закрывают измерительную призму осветительной. Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают окрашенность границы света и тени. Для того чтобы улучшить резкость границы, измерение проводят через 1 мин после нанесения сыворотки на призму, так как за это время из пробы удаляется воздух и происходит лучшее смачивание поверхности осветительной призмы. Осуществляют по шкале "Белок" как минимум 3 наблюдения. Удаляют сыворотку с поверхности призмы рефрактометра, промывают ее водой и протирают фильтровальной бумагой.

Вносят на измерительную призму 2 капли исследуемого молока и проводят по шкале "Белок" как минимум 5 наблюдений, так как резкость границы света и тени у молока хуже, чем у сыворотки. Вычисляют средние арифметические результаты наблюдений для сыворотки и молока.

Массовую долю белка в молоке X1, %, в процентах вычисляют по формуле:

Х1=Х2 – Х3,

Х2 - среднее арифметическое значение результатов измерений по шкале "Белок" для молока, %;

ХЗ - среднее арифметическое значение результатов измерений по шкале "Белок" для сыворотки, %.

Предел допустимой погрешности результата измерений составляет ±0,1 % массовой доли белка при доверительной вероятности 0,90 и расхождении между двумя параллельными определениями не более 0,1 % массовой доли белка.

Окончательный результат есть среднеарифметическое значение результатов измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака.

В сыром коровьем молоке согласно ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию» массовая доля белка должна быть в пределах 2,8-3,6%, но не менее 2,8%. Базисная норма массовой доли белка составляет 3,0%.

Сумм Б. Д. Основы коллоидной химии: учебник для студентов хим. и нехим. спец. - М.: Высшая школа, 2010 - 410 с.

Боровская Л.В. Электронный учебно-методический комплекс дисциплины «Физическая и коллоидная химия: учебно-методический комплекс дисциплины» Учебное пособие. ФГУП НТЦ «ИНФОРМРЕГИСТР» Депозитарий электронных изданий. Москва 2010 .

Феноменологическая модель термокислотной коагуляции белков обезжиренного молока / Л.А. Остроумов, А.М. Осинцев, И.А. Смирнова и др. // Техника и технология пищевых производств. – 2011. – № 1. – С. 133–139.

Транспортировка и хранение скоропортящихся пищевых продуктов. Данилин В.Н., Петрашев В.А., Боровская Л.В.// Известия высших учебных заведений. Пищевая технология. 1996. № 1-2. С. 7

Осинцев, А.М. Роль ионов кальция в коллоидной стабильности мицелл казеина / А.М. Осинцев, В.И. Брагинский О.Ю. Лапшакова А.Л. Чеботарев // Техника и технология пищевых производств. – 2009. – № 1. – С. 63–67

Исследование термодинамических свойств белково-полисахаридной системы методом дифференциальной сканирующей калориметрии /Бугаец Н.А., Тамова М.Ю., Боровская Л.В., Миронова О.П. //Известия высших учебных заведений. Пищевая технология Издательство: Кубанский государственный технологический университет .Краснодар, № 5-6,с.112.

ГОСТ 23327-98. Молоко и молочные продукты. Метод измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определение массовой доли белка: http://docs.cntd.ru/document/gost-23327-98

ГОСТ 25179-90. Молоко. Методы определения белка: http://docs.cntd.ru/document/gost-25179-90

ГОСТ 25179-2014 Молоко и молочные продукты. Методы определения массовой доли белка: http://docs.cntd.ru/document/1200113442

Методы определения белка в молоке формольным и рефрактометрическим методами: https://studfiles.net/preview/4258085/page:6/

Код для цитирования: Скопировать