VIII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2016

Микроорганизмы такие как Bacillus subtilis, Aspergillus niger являются очень важными для промышленного производства ферментов, биологически активных веществ (БАВ), антибиотиков, гормональных препаратов. Это связано с разнообразием метаболических процессов. Они способны синтезировать и выделять большое количество экстраклеточных белков и других веществ, находящих применение в различных областях медицины и сельского хозяйства.

Штаммы микроорганизмов Bacillus subtilis имеют очень большие потенциальные возможности в прикладном аспекте, который включает их применение как пробиотиков, и агентов против патогенной микрофлоры в животноводстве и защите растений, а также производства ферментных препаратов. Немало работ посвящено значению морфологических и физиологических исследований промышленно-важных микроорганизмов. Это влияет на перемешивание, массоперенос и аэрацию в биореакторе. Кроме того, микро-морфология также может влиять на метаболитную продуктивность. В некоторых работах приводятся данные по росту исследуемых микроорганизмов на различных средах, а также влиянию различных факторов.

Таким образом, для создания лекарственных препаратов на основе микроорганизмов, выделенных из регионов Южно-Казахстанской области. Первостепенное значение имеет исследование условий культивирования (рН, концентрация растворенного кислорода, состав питательной среды, способы культивирования), а также определение ферментативной активности выделенных штаммов микроорганизмов.

Штаммы Bacillus Subtilis были выделены из такого материала сена, который является доступным, по методике, описанной в работе, который включает приготовление питательной среды, выделение чистой культуры, культивирование выделенных микроорганизмов на питательных средах, содержащих мясо-пептонный агар [1].

Для культивирования штамма Bacillus subtilis применяют простые и сложные питательные среды. Культивирование проводят при 28-30°С в течение 24-36 часов до достижения плотности культуры (титра клеток) 10 ¹⁰-10¹¹ клеток на мл.

Культивирование [2] было проведено глубинным и стационарным способом, с образованием бактерий во взвешенном состоянии и в виде пленки соответственно.

Гидролитическая активность определяется в надосадочной жидкости из культур, которую получают путем центрифугирования полного объема культуры [3]. В реакционную смесь вводят 900 мл соответствующего полисахаридного субстрата и 100 мл надосадочной жидкости. Пробы по 50 мл отбирают в исходный момент и через каждые 30 мин в течение 1,5-3 ч. Для контроля к субстрату добавляют гомологичную надосадочную жидкость, прогретую в течение 10 мин при 80⁰С. Реакцию останавливают нагреванием проб при 95⁰С в течение 10 мин. Определяют активность путем определения концентрации глюкозы, используя колориметрический метод и группой химических реакций, основанных на способности сахаров (глюкозы) отнимать от ряда соединений кислород [4]. Для определения концентрации глюкозы по колориметрическому методу измеряют оптическую плотность на фотоколориметре при длине волны 490 нм, и по градуированному графику определяют концентрацию моносахарозы. Гидролитическую активность ферментов выделенной глюкозы за 1 мин (мкмоль/мин) рассчитывают на 100 мл надосадочной жидкости исследуемых штаммов [5]. Восстанавливающие свойства глюкозы были использованы при определении реакцией с щелочным раствором сернокислой меди — реакцией Фелинга и реакцией с щелочным раствором висмута — реакцией Ниландера.

В качестве полисахаридных субстратов используется водорастворимый крахмал, экстракты мелассы, пивной дробины, а также глюкоза, сахароза [6].

Клетки выделенного из сена штамма Bacillus subtilis пересевают на агаризованную среду, помещают в термостат при 28°С. После 24-30 часовой инкубации подросшие клетки смывают фосфатным буфером (рН 7,2) или физраствором, переносят в колбы с питательной средой и проводят культивирование при 30°С с аэрацией при перемешивании в течение 24 часов [7,8]. Полученную биомассу центрифугируют и суспендируют в этом же буфере до достижения определенной плотности суспензии.

В данной работе представлены результаты по исследованию гидролитической активности выделенного штамма Bacillus subtilis при глубинном и пленочном культивировании.

Выделенные штаммы Bacillus subtilis были исследованы на способность гидролизовать растительные полимерные углеводы, в качестве источника которых были использованы экстракты мелассы, пивной дробины.

На рисунках 1 показаны результаты определения гидролитической активности надосадочной жидкости, полученной из пленочных культур выделенных штаммов, при стационарном культивировании на подготовленной питательной среде. В качестве субстрата для определения суммарной гидролитической активности использовали отвар пивной дробины. Видно, что при глубинном культивировании суммарные значения гидролитической активности штаммов практически одинаковы. Активность выражается в микромолях субстрата, превращенного за минуту одним мг фермента. Максимальные значения активности наблюдались на 2-й день культивирования; при продолжении культивирования значения активности обоих штаммов выходили на плато и медленно снижались. В сравнении с глубинными стационарные культуры имели более низкий уровень гидролитических ферментов: максимальный уровень суммарной гидролитической активности штамма наблюдался на 4-й день инкубации. Сравнение значений гидролитической активности пленочных и глубинных культур показывает, что более эффективным является глубинное культивирование.

Рисунок 1. Общая гидролитическая активность выделенного штамма при культивировании: 1- пленочном и 2 – глубинном с использованием раствора крахмала

Более замедленная динамика нарастания активности ферментов гидролаз при стационарном культивировании может объясняться дополнительным временем (10-15 ч), которое требуется для формирования пленки. Однако увеличение периода функциональной активности пленочных культур штаммов позволяла в итоге немного увеличить общую гидролитическую активность выделенного штамма.

Максимальный уровень синтеза гидролитических ферментов штаммами при стационарном культивировании был, достигнут путем увеличения объема посевного материала до 10% и использования в качестве инокулюма культуральной жидкости 48-часовых глубинных культур. Данный способ позволяет сократить время культивирования.

Помимо влияния состава питательной среды на рост микроорганизмов B. subtilisбыли исследованы также такие параметры как рН, доступ растворенного кислорода при глубинном культивировании. Результаты исследований показали, что наиболее оптимальными являются рН среды в пределах от 6, 5-8,0, а также непрерывная аэрация среды.

Таким образом, были определены оптимальные условия культивирования выделенных штаммов микроорганизмов, а также возможность использования глубинного культивирования для продукции ферментов гидролитического комплекса, который может гидролизовать крахмал при использовании в качестве субстрата пивной дробины, так как он богат питательными веществами и аминокислотами, необходимыми для роста микроорганизмов.

Выводы

1. Получена чистая культура микроорганизмов Bacillus subtilis, установлено, что при культивировании на питательной среде, содержащей пивную дробину, происходит интенсивный рост, накопление комплекса гидролитических ферментов, при этом наиболее подходящим и оптимальным является по многим причинам глубинное культивирование данного выделенного штамма. Проведенный анализ гидролитической активности пленочных и глубинных культур штаммов указывает на возможность использования глубинного культивирования для продукции ферментов гидролитического комплекса: гидролизующих крахмал, что позволяет применять штамм Bacillus subtilis для переработки различных источников углеводов, таких как экстракты пивной дробины, мелассы и т.д.

2. Применение глубинного культивирования дает возможность вдвое повысить конечную выработку ферментов и использовать более концентрированные крупнодисперсные среды без их предварительного осахаривания.

Литература

[1] Подберезный В.В., Полянцев Н.И., Ропаева Л.В. Культивирование производственных штаммов Bacillus subtilis в подсырной сыворотке // Ветеринария.- 1996.-N 1.-С. 21-29.

[2] Бойко Н.В., Лисецька М.В. Разработка пробиотиков виб 1рковощн: Протискле-ромна эффективность разных штаммов В. subtilis // Наук. вюн. Ужгор. ун-ту. Сер. Бюл. 1997. - N 4. - С. 194-198.

[3] Кудрявцев В.А.,Сафронова JI.A., Осадчая А.И. и др. Влияние живых культур Bacillus subtilis на неспецифическую резистентность организма // Микробиология. Т.58, N 2. 1996 - С. 46-53.

[4] Кузнецова Н.И., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н. и др. Штамм Bacillus thuringiensis, токсичный для комнатной мухи // Биотехнология. 1995. -N3-4.-С. 11-14.

[5] Митрохин С.Д., Шендеров Б.А. Микробиологические и биохимические показатели изменения микробной экологии толстой кишки крыс под влиянием рифампицина. Антибиотики и химиотерапия – 1999.- Т. 34 № 6 (482-4).

[6] Биохимия. Сб. лаб. работ. В.В. Шапкарин, А.П. Королев, С.Б. Гридина, Е.П. Зинкевич. Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. – Кемерово, 2005.-84 с.

[7] Moszer I., Glaser P., Danchin A. SubtiList: A relational database for the Bacillus subtilis genome // Microbiology. 1995. - V. 141, N 2. - P. 261-268.

[8] Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса // Вопр. питан. -1999. -Т.68. -№2. -С.32

Код для цитирования: Скопировать