VIII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2016

Введение. Ферменты - это специфические катализаторы белковой природы. Они вырабатываются клетками и тканями организмов, и которые играют центральную роль в каждом биохимическом процессе. Они катализируют сотни ступенчатых реакций по разрушению питательных веществ, сохранению и трансформации химической энергии и получении биологических макромолекул из простых предшественников. Исследование ферментов имеет огромное практическое значение в связи с применением, которое основано на их высокой каталитической активности и более высокой по сравнению с небиологическими каталитическими системами субстратной специфичностью [1,2].

Целью данного исследования является получение ферментов из Bacillus subtilis, используя в качестве субстрата экстракт пивной дробины.

Ранее авторами [3] приведен аминокислотный состав сухой пивной дробины, где показано, что при анализе особое внимание уделяется содержанию незаменимых аминокислот, которые обусловливают биологическую ценность белков.

Методы исследования. В работе проведен скрининг амилолитической активности B. Subtilis, где для его выявления использовали среду Лоурия-Бертони (LA), в который вносится 1%-ный раствор крахмала. После инкубирования микроорганизмов раствор Люголя был добавлен для идентификации окрашенной зоны. По наличию окрашивания и его диаметра, образованного после добавления раствора Люголя, устанавливают амилолитическую активность культуры [4,5].

Амилолитическая активность. Для выявления амилолитической активности использовали плотные питательные среды: MRS (Merck) - для лактобацилл и Лоурия-Бертони (LA) - для остальных бактерий, в которые вносили 1% во-дорастворимый картофельный крахмал. Исследуемые микроорганизмы высевали штрихом на чашки Петри и инкубировали при 37 о С в течение 2 – 5 суток. Гидролиз крахмала обнаруживали по бесцветным зонам вокруг штриха (колоний) после обработки агаровой пластинки раствором Люголя. Среда, содержащая крахмал, окрашивалась в синий цвет.

Состав питательной среды. В 1 литре дистиллированной воды растворяют 6 г. бактериологического пептона, 0,5 г. MgSO₄.7H₂O, 0,5 г. KCL, 1 г. субстрата. Затем 100 мл среды в конической колбе подогревается на плитке и стерилизуется в автоклаве при 120⁰С.

Определение протеолитической активности. Определение протеолитической активности проводили по гидролизу 1 % раствора казеина протеазами исследуемых штаммов. За единицу протеолитической активности принимали количество фермента, которое за 1 мин при 37°Си рН 7,2 повышает в неосаждаемых трихлоруксусной кислотой продуктах протеолиза содержание тирозина на 1 микроэквивалент или за 10 мин при той же температуре повышает оптическую плотность раствора при 280 нм на 1 единицу.

Исследование влияния рН на выход амилазы. Влияние рН было исследовано для значений рН от 6 до 9 для B. subtilis, выход амилазы исследован по методу ДНСК [6,7].

Определение редуцирующих сахаров по реакции с 3,5 – диннитросалициловой кислотой. При взаимодействии сахаров с 3, 5 – динитросалициловой кислотой последняя восстанавливается в 3-амино 5-нитросалициловую кислоту. В мерной колбе на 1 литр в дистиллированной воде растворяют 10 г. 3,5 динитросалициловой кислоты, 300 г. Сегнетовой соли, 16 г. Едкого натра и доводят до метки водой. Раствор выдерживают два дня в темном месте, затем фильтруют в склянку оранжевого цвета и хранят в темноте. К 1 мл испытуемого раствора приливают 2 мл динитросалицилового реактива, нагревают 5 мин. В кипящей водяной бане, охлаждают до комнатной температуры, доводят до объема 25 мл. Определение оптической плотности проводят при 530 нм (зеленый светофильтр).

Определение гидролитической активности. Гидролитическая активность определяется в надосадочной жидкости из культур, которую получают путем центрифугирования полного объема культуры. В реакционную смесь вводят 900 мл соответствующего полисахаридного субстрата и 100 мл надосадочной жидкости. Пробы по 50 мл отбирают в исходный момент и через каждые 30 мин в течение 1,5-3 ч. Для контроля к субстрату добавляют гомологичную надосадочную жидкость, прогретую в течение 10 мин при 80⁰С. Реакцию останавливают нагреванием проб при 95⁰С в течение 10 мин. Определяют активность путем определения концентрации глюкозы, используя колориметрический метод. Для этого измеряют оптическую плотность на фотоколориметре при длине волны 490 нм, и по градуированному графику определяют концентрацию моносахарозы. Гидролитическую активность ферментов выделенной глюкозы за 1 мин (мкмоль/мин) рассчитывают на 100 мл надосадочной жидкости исследуемых штаммов.

В качестве полисахаридных субстратов используется водорастворимый крахмал, а также экстракт пивной дробины.

Результаты и обсуждение. В данной работе представлены результаты по исследованию амилолитической, протеолитической и гидролитической активности выделенного штамма Bacillus subtilis при глубинном культивировании.

Выделенные штаммы Bacillus subtilis были исследованы на способность гидролизовать растительные полимерные углеводы, в качестве источника которых была использована пивная дробина.

Рисунок 1 показывает влияние рН на активность ферментов, вырабатываемых B. subtilis. Было установлено, что наиболее оптимальным рН для амилолитической и протеолитической активности является 9 при концентрациях 1,15 и 0,8 мг/мл/сек соответственно.

 

1

 

1 – амилаза; 2 - протеаза

Рисунок 1. Влияние рН на выход ферментов амилазы и протеазы, продуцируемых B.subtilis

В сравнении с глубинными стационарные культуры имели более низкий уровень гидролитических ферментов: максимальный уровень суммарной гидролитической активности штамма наблюдался на 4-й день инкубации. Сравнение значений гидролитической активности пленочных и глубинных культур показывает, что более эффективным является глубинное культивирование.

Более замедленная динамика нарастания активности ферментов гидролаз при стационарном культивировании может объясняться дополнительным временем (10-15 ч), которое требуется для формирования пленки.

Помимо суммарной гидролитической активности с использованием в качестве субстрата отвара пивной дробины была определена гидролитическая активность надосадочной жидкости штаммов в отношении крахмала (табл.1).

Таблица 1 - Активность внеклеточных гидролаз в глубинных и пленочных культурах штаммов

Штамм	Время культивирования	Скорость образования продуктов реакции (мкмоль/мин. при гидролизе различных субстратов)
		Крахмал	Экстракт пивной дробины
выделенный штамм	72 ч., глубинное	15,6	26,1

Выводы.

Видно, что глубинное культивирование при использовании экстракта пивной дробины почти вдвое повышает уровень продуцируемой гидролитической активности штамма по-сравнению, если в качестве субстрата был использован крахмал.

Таким образом, проведенный анализ глубинных культур штаммов указывает на возможность использования глубинного культивирования для продукции ферментов амилолитического, протеолитического и гидролитического комплекса, который может гидролизовать крахмал и целлюлозу при использовании в качестве субстрата пивной дробины.

Литература

[1] Babbitt P.C. GerltJ.A. Understanding enzyme superfamilies: chemistry as the fundamental determinant in the evolution of new catalytic activities. J. Biol. Chem. 27, 30, 1997.-591–30, 594.

[2] Lerner R.A., Benkovic S.J., Schulz P.G. At the crossroads of chemistry and immunology: catalytic antibodies. Science. 1991.- 252, 659–667.

[3] Burhan A, Nisa U, Gokhan C., Ashabil A. and Osmair G. Enzymatic Properties of a novel thermostablether-mophilic alkaline and chelator resistant amylase from an al-kaphilic Bacillus spIsolate ANT-6. Process Biochemistry. (38): 2003. 1397–1403

[4] Mitra P., Chakraverty R., Chandra A. L. Pro-duction of proteolytic enzyme in solid state fermentation system.Brazilian Journalof Science Research (55): 1994.-439–442

[5] Волотка Ф.Б., Богданов В.Д. Технологическая и химическая характеристика пивной дробины. Вестник ТГЭУ. №1.2013.-С.114-124.

[6] Бруслик Н.Л., Каюмов А.Р., Богачев М.И., Яруллина Д.Р. Сравнительная характеристика амилолитической активности грамположительных бактерий. Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация, 2014.- № 2. C. -47-51.

[7] Bertrand, T.F., Frederic, T. and Robert, N. Production and Partial Characterization of a thermostable amylase from Ascomycetes yeast strain isolated from starchy soil. McGraw-Hill Inc., New York. pp. 2004.-53-55.

[8] Шапкарин В.В., Королев А.П., Гридина С.Б., Зинкевич Е.П. Биохимия. Сборник лабораторных работ. Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. – Кемерово, 2005.-84 с.

Код для цитирования: Скопировать