VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

На сегодняшний день диагностика и лечение микоплазменных инфекций –актуальная проблема, затрагивающая как минимум половину населения нашей планеты. Хотя до недавнего времени, при отсутствии выраженных симптомов болезни, микоплазмы считались нормальными компонентами микрофлоры человека, последние исследования показали ошибочность этой точки зрения. По различным данным в России до 60% женщин носительствуют по микоплазме.

Проблема диагностики и лечения встает наиболее остро в связи с тем, что микоплазмоз передается не только половым путем, но и от матери к ребенку, что приводит к нарушениям развития плода и спонтанным абортам, а значит снижению рождаемости.

К тому же, около 34% раковых гиперплазий и опухолей простаты являются следствием вялотекущего хронического воспаления, вызванного микоплазмой.

Тем не менее, из-за низкой иммуногенности этого патогена и сложностей изучения, в настоящее время не существует эффективных средств диагностики и лечения микоплазменных инфекций у человека.

В связи с этим, в последнее время активно изучается возможность разработки средств диагностики и лечения микоплазменных инфекций на основе наноантител.

Классические антитела состоят из двух тяжелых и двух легких цепей. Каждая из цепей, в свою очередь, состоит из одного вариабельного домена и нескольких константных доменов. Такие антитела встречаются у большинства животных и человека.

Однако, у некоторых представителей млекопитающих, например, верблюдов антитела устроены проще: они не имеют легких цепей и состоят из двух тяжелых цепей.

Именно вариабельные домены антител верблюдов и называются наноантителами потому как, при их изоляции от константных доменов антитела, они сохраняют за собой способность связываются с антигенами так же как и обычные антитела.

В сравнении с классическими антителами наноантитела обладают следующими преимуществами:

1. небольшой размер, что обеспечивает высокую проникающую способность в места локализации микоплазмы;

2. кодируются всего одним геном;

3. обладают высокой аффинностью;

4. обладают высокой специфичностью;

5. низкая иммуногенность;

6. способность быстро элиминироваться из организма;

7. устойчивость к изменениям рН;

8. термостабильность.

Эти преимущества позволяют использовать наноантитела в качестве эффективных средств диагностики и лечения микоплазменных инфекций.

Почему же мы не можем использовать для этих целей классические антитела? Дело в том, что классические антитела могут быть получены только в специальных эукариотических системах – гибридомах. Получение их в прокариотических продуцентах невозможно.

В отличие от классических антител наноантитела могут быть получены в бактериальных продуцентах, а значит, производство наноантител является экономически целесообразным.

В связи с этим, целью данной работы являлось получение бактериального продуцента на основе E.coli штамма М15, эффективно продуцирующих рекомбинантные наноантитела против Mycoplasma hominis.

Таким образом, предстояло решить следующие задачи:

1)получить плазмиду, несущую ген наноантитела, а также гены вспомогательных белков;

2)Клонировать полученную генетическую конструкцию под контроль промотора лактозного оперона;

3)получить эффективный бактериальный продуцент рекомбинантных наноантител против Mycoplasma hominis.

Для выполнения поставленных задач были использованы различные молекулярно-биотехнологические, биохимические и иммунологические методы.

Обратимся к принципиальной схеме получения рекомбинантных наноантител.

Вначале была проведена иммунизация верблюдов материалом, обогащенным заданным антигеном – Mycoplasma hominis.

Из суспензии полученных лимфоцитов была выделена мРНК.

Методом ПЦР на матрице РНК была получена кДНК, которая затем встраивалась в вектор фагового дисплея.

Через технологию фаговых дисплеев были отобраны рабочие клоны наноантител, после чего их гены были трансформировны в клетки E.coli, в которых происходит наработка наноантител в препаративных количествах.

Представленная работа заключалась в выполнении двух последних этапов, представленных на схеме.

На первом этапе работы был сконструирован ген, последовательно состоящий из:

1)пептида pelB

Специальный пептид, направляющий синтезированные в клетке наноантитела в периплазматическое пространство бактерии.

2)наноантитела против Mycoplasma hominis

3)изолейцинового зиппера

Цепочка аминокислот, тримеризующая наноанитела.

4)полигистидиновой последовательности

Необходима для аффинной очистки наноантител за счет связывания с ионами Ni.

Второй этап работы заключался в клонировании сконструированного гена под контроль промотора лактозного оперона.

Полученная генетическая конструкция методом трансформации была доставлена в бактериальные клетки E.coli штамма М15, содержащие репрессор лактозного оперона.

Принцип действия лактозного оперона прост: при добавлении лактозы в питательную среду бактерий инициируется синтез рекомбинантных наноантител. При отсутствии лактозы в питательной среде синтез наноантител прекращается. Данный принцип позволяет регулировать оптимальный уровень экспрессии наноантител.

Заключительным этапом данной работы стала отработка условий экспрессии наноантител и их очистка методом Ni – аффинной хроматографии.

По результатам эксперимента минимально необходимое время для экспрессии значительного количества наноантител составило 30-60 минут.

Отметим, что минимально необходимое время для экспрессии классических антител составляет от 24 часов до нескольких суток.

Методом ИФА мы показали, что полученные нами препарат наноантител функционально активен и в дальнейшем может быть использован для диагностики.

По предварительным расчетам стоимость затрат на производство и очистку наноантител составила около 100 рублей за 1 грамм продукта, что минимум в 500 раз меньше, чем за аналогичное количество любых классических антител.

В результате проведенной работы можно сделать следующие выводы:

1. Впервые был создан эффективный бактериальный продуцент наноантител, специфических к Mycoplasma hominis;

2. Отработаны условия продукции и очистки наноантител;

3. Показана их функциональная активность и применимость для детекции данного патогена.

Данная работа является частью комплексного исследования, продолжением которого является:

1. Дизайн и внедрение в клиническую диагностику тест-системы для диагностики Mycoplasma hominis;

2. Изучение негативного действия данных наноантител на патоген ;

3. Присоединение к наноантителам видоспецифического Fc-фрагмента для усиленного привлечения макрофагов к борьбе против микоплазменной инфекции;

4. Проведение экспериментов in vivo и доклинические испытания разрабатываемого препарата наноантител.

Список использованной литературы:

1. Cortez-Retamozo V., Backmann N., Senter P.D., Wernery U., De Baetselier P., Muyldermans S., Revets H. Efficient cancer therapy with a nanobodybased conjugate. // Cancer Res. 2004. V. 64.

2. Ahmadvand D., Rasaee M.J., Rahbarizadeh F., Mohammadi M. Production and characterization of a high-affinity nanobody against human endoglin. // Hybridoma (Larchmt). 2008. V. 27.

3. Cortez-Retamozo V., Lauwereys M., Hassanzadeh Gh.G., Gobert M., Conrath K. et al. Efficient tumor targeting by single-domain antibody fragments of camels. // Int. J. Cancer. 2002. V. 98.

4. Ahmadvand D., Rasaee M.J., Rahbarizadeh F., Kontermann R.E., Sheikholislami F. Cell selection and characterization of a novel human endothelial cell specific nanobody. // Mol. Immunol. 2009. V. 46.

5. Arbabi-Ghahroudi M., Desmyter A., Wyns L., Hamers R., Muyldermans S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. // FEBS Lett. 1997. V. 414.

6. Tijink B.M., Laeremans T., Budde M., Stigter-van Walsum M., Dreier T., de Haard H.J., Leemans C.R., van Dongen G.A. Improved tumor targeting of antiepidermal growth factor receptor nanobodies through albumin binding: Taking advantage of modular Nanobody technology. // Mol. Cancer Ther. 2008. V. 7.

7. Rahbarizadeh F., Ahmadvand D., Sharifzadeh Z. Nanobody; an old concept and new vehicle for immunotargeting // Immunol Invest. 2011. V. 40(3).

8. Frenken L.G., van der Linden R.H., Hermans P.W., Bos J.W., Ruuls R.C., de Geus B., Verrips C.T. Isolation of antigen specific llama VHH antibody fragments and their high level secretion by Saccharomyces cerevisiae. // J. Biotechnol. 2000. V. 78.

9. Desmyter A., Transue T. R., Ghahroudi M. A., Thi M. H., Poortmans F., Hamers R. et al. Crystal structure of a camel single-domain VH antibody fragment in complex with lysozyme. // Nat. Struct. Biol. 1996. V. 3.

10. Berdichevsky Y., Ben-Zeev E., Lamed R., Benhar I. Phage display of a cellulose binding domain from Clostridium thermocellum and its application as a tool for antibody engineering.// J. Immunol. Methods. 1999. V. 228.

11. Van de Broek B., Devoogdt N., D'Hollander A., Gijs H.L., Jans K., Lagae L., Muyldermans S., Maes G., Borghs G. Specific cell targeting with nanobody conjugated branched gold nanoparticles for photothermal therapy // ACS Nano. 2011. V. 5(6).

12. Bond C.J., Marsters J.C., Sidhu S.S. Contributions of CDR3 to VHH domain stability and the design of monobody scaffolds for naive antibody libraries. // J. Mol. Biol. 2003. № 332.

13. Borrebaeck C.A., Malmborg A.C., Furebring C., Michaelsson A., Ward S., Danielsson L., Ohlin M. Kinetic analysis of recombinant antibody-antigen interactions: relation between structural domains and antigen binding // Biotechnology. 1992. V. 10.

14. Davison E., Diaz R.M., Hart I.R., Santis G., Marshall J.F. Integrin α5β1-mediated adenovirus infection is enhanced by the integrinactivating antibody TS2/16. // J. Virol. 1997. V. 71.

15. Dumoulin M., Conrath K., Van Meirhaeghe A., Meersman F., Heremans K., Frenken L.G., Muyldermans S, Wyns L, Matagne A. Single-domain antibody fragments with high conformational stability // Protein Sci. 2002. V.11.

16. Els Conrath K., Lauwereys M., Wyns L., Muyldermans S. Camel singledomain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276.

Код для цитирования: Скопировать