VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

Список сокращений: Ад – аденовирус человека; Ад5 – Aд серотипа 5; Aд35 – Aд серотипа 35; БОЕ – бляшкообразующая единица; ИЛ-2 – интерлейкин-2 человека; ККМ – красный костный мозг; Ad5-IL2 – рекомбинантный Ад5, экспрессирующий ген ИЛ-2; Ad5/35-IL2 – рекомбинантный Ад5 с модифицированными фиберами, экспрессирующий ген ИЛ-2; CAR – коксакивирусный-аденовирусный рецептор; CD – кластер дифференцировки; НЕК-293 – клетки почки эмбриона человека (пакующая линия клеток); KG-1A – культура клеток миелоцитарного лейкоза; U937 – культура клеток моноцитарного лейкоза.

В настоящее время рекомбинантные аденовирусы широко применяются в качестве векторов для доставки и экспрессии генов в клетках млекопитающих и человека [5, 6]. Одним из наиболее перспективных направлений является использование векторов на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ад5). По сравнению с другими векторами они обладают рядом преимуществ, к которым относятся большая пакующая емкость, высокая стабильность вирионов и другие [16, 17].

Однако недостатком таких векторов является ограниченность спектра клеток, в которые они могут эффективно проникать.

Это связано с малым содержанием или полным отсутствием на поверхности клеток первичного рецептора CAR (coxsackievirus and adenovirus receptor, коксакивирусный-аденовирусный рецептор), с которым связывается Ад5. К CAR-дефицитным и CAR-негативным клеткам относятся гладкомышечные, гемопоэтические клетки, а также многие линии опухолевых клеток [9, 14, 15]. Однако, по литературным данным известно, что на поверхности большинства CAR-негативных клеток присутствует другой рецептор – CD46, с которым Ад5 связываться не может. В семействе Adenoviridae выделяют несколько серотипов, которые могут эффективно связываться с рецептором CD46, к ним относят аденовирус человека 35 серотипа (Ад35). В связи с этим, чтобы рекомбинантный аденовирус мог связываться с данным рецептором, предложена генетическая модификация белка фибера, обеспечивающего адсорбцию вируса на поверхности клетки и его дальнейшее проникновение. Модификация заключается в замене фибера или отдельных его доменов на фибер или домены аденовируса другого серотипа, который использует для связывания с поверхностью клетки рецептор, отличный от CAR. Такая стратегия модификации носит название «псевдотипирование» [8, 10, 11].

В данной работе была предложена замена глобулярного домена фибера Ад5 на аналогичный домен фибера Ад35, что в результате должно было привести к изменению тропизма аденовируса и возможности его эффективного проникновения в CD46-позитивные опухолевые клетки [13, 18, 19]. Такое свойство аденовектора может быть использовано для различных целей, в том числе для противоопухолевой терапии [4, 17].

Рассмотрим возможные подходы: известно, что одним из механизмов противоопухолевой защиты является элиминация опухоли с помощью цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров. Их пролиферация и дифференцировка в организме стимулируется интерлейкином-2 (ИЛ-2), секретируемым Т-хелперами [2, 3, 12].

Если ген ИЛ-2 человека внедрить в геном рекомбинантного аденовируса, способного эффективно проникать в CD46-позитивные опухолевые клетки, мы можем получить вектор для доставки этого гена в гемопоэтические клетки. Попав в них, ген ИЛ-2 будет экспрессироваться, а его продукт, ИЛ-2, секретироваться из клеток и стимулировать пролиферацию и дифференцировку цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров. Такой эффект в конечном счете может приводить к активной элиминации опухолевых клеток [1, 7].

В связи с этим, целью настоящей работы являлось получение рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа с модифицированным фибером для эффективной доставки гена интерлейкина-2 в гемопоэтические клетки.

Для осуществления поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Получить плазмидную конструкцию, содержащую полноразмерный геном аденовируса человека 5 серотипа с геном модифицированного фибера и несущую ген ИЛ-2;

2. Получить рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа с модифицированным фибером и несущий ген ИЛ-2; определить концентрацию и титр рекомбинантного аденовируса в полученном препарате;

3. Изучить уровень экспрессии гена ИЛ-2 invitro в клетках миелоцитарного и моноцитарного лейкозов, трансдуцированных полученным рекомбинантным аденовирусом;

4. Изучить уровень экспрессии гена ИЛ-2 exvivo в клетках лейкоцитарной фракции красного костного мозга человека, трансдуцированных полученным рекомбинантным аденовирусом.

Первый этап работы заключался в получении плазмидной конструкции, несущей ген ИЛ-2. Для этого ген ИЛ-2 из коммерческой плазмиды клонировали в вектор, содержащий фрагмент генома Ад5. В результате была получена плазмида, несущая целевой ген ИЛ-2 и фрагмент генома вируса.

Второй этап работы заключался в получении плазмиды, содержащей полноразмерный геном Ад5 с геном модифицированного фибера и ген ИЛ-2. Для этого использовали плазмиду, полученную на предыдущем этапе работы, и пазмиду, содержащую полноразмерный геном Ад5 с геном модифицированного фибера. В результате гомологичной рекомбинации была получена плазмидная конструкция, несущая полноразмерный геном Ад5 с геном модифицированного фибера и ген ИЛ-2.

Рекомбинантный Аd5/35-IL2 получали методом трансфекции пакующей линии клеток (НЕК-293) полученной плазмидной конструкцией. В результате трансфекции на выходе получали модифицированные аденовирусные частицы.

Для накопления аденовируса заражали пакующую линию клеток. Инфицированные клетки собирали и проводили очистку и концентрирование аденовируса.

Затем определяли титр и концентрацию вирусных частиц в готовом препарате (табл. 1).

Таблица 1

Концентрация и титр рекомбинантных аденовирусов

Название вируса	Концентрация препарата, вч/мл	Титр препарата, БОЕ/мл	Соотношение, вч/БОЕ
Ad5/35-IL2	(4,23±0,17)×1012	(2,12±0,26)×1010	199,53
Ad5-IL2 (контроль)	(6,97±0,19)×1012	(5,85±0,76)×1010	119,15

Вы можете видеть, что титр модифицированного вируса в 2,5 раза меньше контроля. Снижение титра препарата не является критичным, учитывая высокую проникающую способность данного вируса в сравнении с контрольным образцом, что было продемонстрировано в наших следующих экспериментах.

Для определения уровня экспрессии гена ИЛ-2, доставляемого модифицированным аденовирусом invitro, были использованы культуры клеток миелоцитарного и моноцитарного лейкозов линий KG-1A и U937 соответственно. Результаты эксперимента показали, что немодифицированный вирус практически не проникал в клетки данных линий, в связи с чем уровень экспрессии ИЛ-2 был детектирован в следовых количествах. Между тем, полученный нами модифицированный вирус показал способность эффективно проникать в клетки и обеспечивать в них на высоком уровне экспрессию гена ИЛ-2 (рис. 1).

Рис. 1. Уровень экспрессии гена ИЛ-2 в культуральной среде линий клеток KG-1A и U937, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами, через 48 часов после заражения.

Изучив уровень экспрессии ИЛ-2 invitro, мы исследовали эффективность доставки этого гена в клетки красного костного мозга здорового донора exvivo.

В опыте по трансдукции первичной культуры лейкоцитов теми же рекомбинантными аденовирусами было показано увеличение экспрессии гена ИЛ-2 в 30 раз в случае с полученным модифицированным аденовирусом (рис. 2).

Рис. 2. Уровень экспрессии гена ИЛ-2 в культуральной среде клеток лейкоцитарной фракции ККМ человека, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами, через 48 ч после заражения.

Исходя из полученных данных, очевидно, что рекомбинантный аденовирус с модификацией фибера более эффективно проникает в клетки лейкоцитарной фракции ККМ и обеспечивает экспрессию гена ИЛ-2 по сравнению с контрольным образцом.

Основываясь на полученных результатах, можно сделать следующие выводы:

1. Получена плазмидная конструкция, содержащая полноразмерный геном аденовируса человека 5 серотипа с геном модифицированного фибера и несущая ген ИЛ-2;

2. Впервые получен рекомбинантный аденовирус с модифицированным фибером, несущий ген ИЛ-2; в полученном аденовирусном препарате концентрация вирусных частиц составила (4,23 ± 0,17)×10¹² вч/мл, титр – (2,12 ± 0,26)×10¹⁰ БОЕ/мл;

3. Invitro продемонстрировано увеличение уровня экспрессии гена ИЛ-2 при трансдукции клеток KG-1A и U937 вектором Ad5/35-IL2 в сравнении с немодифицированным вектором Ad5-IL2; концентрация ИЛ-2 в культуральной среде линий клеток KG-1A и U937 после трансдукции вектором Ad5/35-IL2 составила 748,3 ± 32,8 пг/мл и 421,5 ± 59,4 пг/мл соответственно;

4. Определена концентрация ИЛ-2 в культуральной среде клеток лейкоцитарной фракции ККМ человека, трансдуцированных полученным рекомбинантным аденовирусом, которая составила 3682,52 ± 134,21 пг/мл.

Полученные результаты дают возможность предположить использование полученного рекомбинантного аденовируса в качестве эффективного средства противоопухолевой терапии.

В продолжение данных исследований планируется определение субпопуляций лейкоцитов красного костного мозга, в которые эффективно проникает Ad5/35-IL2, изучение биологической активности экспрессируемого ИЛ-2 человека, а так же исследование противоопухолевого действия полученного аденовирусного вектора в экспериментах invivo на линиях трансгенных мышей с привитыми подкожными опухолями.

Список используемой литературы

1. Addison C. Intratumoral coinjection of adenoviral vectors expressing IL-2 and IL-12 results in enhanced frequency of regression of injected and untreated distal tumors / Addison C.L., Bramson J.L., Hitt M.M., Muller W.J., Gauldie J., Graham F.L. // Gene Ther. 1998. Vol. 5. – P. 1400-1409.

2. Antony G.K. Interleukin 2 in cancer therapy / Antony G.K., Dudek A.Z. // Curr. Med. Chem. 2010. Vol. 17. – N29. – P. 3297-3302.

3. Atkins M.B. Interleukin-2: clinical applications / Atkins M.B. // Semin. Oncol. 2002. Vol. 29. – N3. – P.12-27.

4. Atkins M.B. High-dose recombinant interleukin-2 therapy in patients with metastatic melanoma: long-term survival update / Atkins M.B., Kunkel L. Sznol M. Rosenberg S.A. // Cancer J. Sci. Am. 2000. Vol. 6. – P. 11-24.

5. Bouard D. Viral vectors: from virology to transgene expression / Bouard D., Alazard-Dany N., Cosset F.-L. // British Journal of Pharmacology. 2009. Vol. 157. – P. 153-165.

6. Curiel D. T., Douglas J. T. Adenoviral vectors for gene therapy / Curiel D. T., Douglas J. T. // Elsevier Science (USA), 2002. – 673 p.

7. Dillman R.O. What to do with IL-2? / Dillman R.O. // Cancer Biother. Radiopharm. 1999. Vol.14. – N6. – P.423-434.

8. Gall J. Adenovirus type 5 and 7 capsid chimera: fiber replacement alters receptor tropism without affecting primary immune neutralization epitopes / Gall J., Kass-Eisler A., Leinwand L., Falck-Pedersen E. // Journal of Virology. 1996. Vol. 70. – N4. – P. 2116-2123.

9. Iguchi K. Efficient antitumor effects of carrier cells loaded with a fiber-substituted conditionally replicating adenovirus on CAR-negative tumor cells / Iguchi K., Sakurai F., Tomita K., Katayama K., Yamaguchi T. et al. // Cancer Gene Therapy. 2012. Vol. 19. – P. 118-125.

10. Kaufmann J.K. Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond / Kaufmann J.K., Nettelbeck D.M. // Trends in Molecular Medicine. 2012. Vol. 18. – P. 365-376.

11. Krasnykh V.N. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism / Krasnykh V.N., Mikheeva G.V., Douglas J.T., Curiel D.T. // Journal of Virology. 1996. Vol. 70. – P. 6839-6846.

12. Liao W. Interleukin-2 at the crossroads of effector responses, tolerance, and immunotherapy / Liao W., Lin J.-X., Leonard W.R. // Immunity. 2013. Vol. 38. – P. 13-25.

13. Matsui H. Enhanced transduction efficiency of fiber-substituted adenovirus vectors by the incorporation of RGD peptides in two distinct regions of the adenovirus serotype 35 fiber knob / Matsui H., Sakurai F., Katayama K., Kurachi S., Tashiro K. et al. // Virus Research. 2011. Vol. 155. – P. 48-54.

14. Na M. Design of Ad5F35 vectors for coordinated dual gene expression in candidate human hematopoietic stem cells / Na M., Fan X. // Exp. Hematol. 2010. Vol. 38. – N6. – P. 446-452.

15. Nigatu A.S. Evaluation of cell-penetrating peptide/adenovirus particles for transduction of CAR-negative cells / Nigatu A.S., Vupputuri S., Flynn N., Neely B.J., Ramsey J.D. // J. Pharm. Sci. 2013. Vol. 102. – N6. – P. 1981-1993.

16. Russell W.C. Role of adenovirus structural components in the regulation of adenovirus infection / Russell W.C., Kemp G.D. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995. Vol. 199. – N1. – P. 81-98.

17. Russell W. C. Update on adenovirus and its vectors / Russell W. C. // J. of General Virology. 2000. Vol. 81. – P. 2573-2604.

18. Schneider-Schaulies J. Receptor (CD46) modulation and complement-mediated lysis of uninfected cells after contact with measles virus-infected cells / Schneider-Schaulies J., Schnorr J., Schlender J., Dunster L.M., Schneider-Schaulies S., Volker T. M. // Journal of Virology. 1996. Vol. 70. – N1. – P. 255-263.

19. Shayakhmetov D.M. Efficient gene transfer into human CD34(+) cells by a retargeted adenovirus vector / Shayakhmetov D.M., Papayannopoulou T., Stamatoyannopoulos G., Lieber A. // Journal of Virology. 2000. Vol. 74. – P. 2567-2583.

8

Код для цитирования: Скопировать