XVII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2025

Актуальность темы: В настоящее время в лабораторной диагностике существует огромное количество методов, позволяющих проводить диагностику наличия того или иного вещества в биологических жидкостях организма. Одним из таких методов является иммуноферментный анализ (ИФА).

Сегодня ИФА используется во всех областях современной медицины, особенно в диагностических и аналитических целях. Особенно важно, что ИФА позволяет определять биологические компоненты (гормоны, ферменты, нейропептиды, продукты иммунной системы, антигены и т.д.) в низких или очень низких концентрациях. Иммуноферментный анализ сегодня является удобным и универсальным методом лабораторной диагностики, поскольку позволяет обнаружить все продукты, способные вырабатывать антитела.

Цель исследования: изучить особенности иммуноферментного анализа.

Иммуноферментный анализ — лабораторный метод диагностики, основанный на реакции антиген-антитело, в ходе которой выявляются вещества, обладающие свойствами белка (в том числе ферменты, вирусы, фрагменты бактерий и другие компоненты биологических жидкостей).

Принцип иммуноферментного анализа (ELISA) заключается в образовании иммунных комплексов в результате специфического взаимодействия антигена и антитела с последующим обнаружением комплексов с помощью спектрофотометрии, хемилюминесценции или других подходящих методов. Образование иммунных комплексов происходит по схеме «антиген (испытуемое вещество) - специфическое антитело» или наоборот. Образование иммунного комплекса, сформированного на предыдущем этапе, или конъюгата со свободным сайтом связывания (детерминантом). Превращение субстрата в детектируемый сигнал в результате биохимической реакции под действием фермента-метки.

Процедура проведения: биологический материал (сыворотка крови, моча и др.) помещается в чистую лунку на достаточное время (обычно 15-30 минут), чтобы антиген прилип к поверхности лунки. Затем в лунки добавляют антитело, меченное против выявляемого антигена (конъюгат). Смесь выдерживают некоторое время (от 30 минут до 4-5 часов), чтобы конъюгированное антитело нашло и связалось со «своим» антигеном. Содержимое лунок выливают (или промывают декантацией), чтобы удалить «лишнее» антитело. В результате остаются только те антитела, которые связываются с антигенами, «прикрепленными» к поверхности лунки.

Следующий шаг - ферментативная реакция. В промытые лунки добавляют раствор, содержащий фермент, и оставляют на 30-60 минут. Фермент обладает сродством к веществу (специфическому маркеру), с которым связывается антитело. Фермент вступает в реакцию, превращая специфическую метку (субстрат) в окрашенное вещество (продукт). Интенсивность окрашивания зависит от количества обнаруженного специфического антитела. Результаты оцениваются спектрофотометрически или визуально.

Наиболее часто в настоящее время используется тверднофазный ИФА метод.

Основной принцип твердофазного ИФА:

1. На первом этапе реакции антиген или антитело адсорбируется на твердой фазе. Любой реагент, не связанный с твердой фазой, легко удаляется промывкой.

2. Образцы инкубируются в сенсибилизированных лунках. Стандартные реагенты инкубируются в лунках положительного контроля. Иммунные комплексы образуются на поверхности твердой фазы. Несвязанные компоненты удаляются промывкой.

3. При добавлении антитело-ферментных комплексов или антиген-ферментных комплексов и их связывании с иммобилизованными иммунными комплексами активный центр фермента остается готовым к взаимодействию с субстратом. Инкубация субстрата в лунках, где иммобилизован конъюгат, вызывает хромогенную реакцию. Реакцию можно остановить на любом этапе и оценить степень окрашивания визуально или по оптической плотности.

Некоторые модификации твердофазного ИФА:

1. Сэндвич-метод. Раствор, содержащий анализируемый антиген, добавляется к носителю, на котором иммобилизовано антитело. На первом этапе инкубации на твердой фазе образуются комплексы антиген-антитело. Затем носитель промывают, чтобы удалить несвязанные компоненты, и добавляют специфические антитела, меченные ферментом. После второй инкубации для удаления избытка конъюгата антитело-фермент измеряется ферментная активность носителя. Активность фермента пропорциональна исходной концентрации исследуемого антигена.

2. Непрямой метод ИФА Антиген иммобилизуется на твердой фазе и инкубируется с исследуемым веществом для удаления несвязанных компонентов, затем добавляется меченное ферментом антитело против иммуноглобулинов человека класса IgG, которое взаимодействует с Fc-фрагментом IgG. После субстратно-ферментной реакции результаты регистрируются. Если антитела присутствуют, уровень оптической плотности реакции выше, чем у отрицательных образцов.

3. Конкурентный метод. Исследуемое вещество и конъюгат одновременно добавляются к иммобилизованному антигену на твердой фазе. В ходе реакции меченое антитело и тестируемое антитело конкурируют за активный центр антигена, иммобилизованного на твердой фазе. После завершения инкубации удаление непрореагировавших компонентов приводит к ферментативной реакции, результат которой обратно пропорционален количеству антител в исследуемом веществе.

4. Прямой ИФА. На первом этапе реакции измеряемый образец иммобилизуется на твердой фазе. Затем добавляется конъюгат. После удаления непрореагировавших реактивных компонентов происходит ферментативная реакция, интенсивность которой прямо пропорциональна содержанию антигена в образце, что свидетельствует о наличии антигена в образце.

В иммуноферментном анализе используются синтетические антитела (иммуноглобулины), которые могут связываться с антигенами и образовывать иммунные комплексы. Такие комплексы легко распознаются и разрушаются иммунными клетками.

Существует несколько типов антител, каждый из которых участвует в определенном этапе иммунного ответа. Сначала они синтезируются при попадании антигена в организм. Содержание этих антител наиболее высоко в первые несколько дней инфекционного процесса. Иммуноглобулины класса G (IgG). Они помогают уничтожить антиген до тех пор, пока инфекция не будет полностью изжита, а затем продолжают циркулировать в кровеносных сосудах, обеспечивая иммунитет против повторного заражения.

Библиотеки фаговых антител также могут быть использованы в ИФА. Библиотеки фаговых антител представляют собой популяции бактериофагов, несущих Fab-фрагменты или sdAb-антитела. Существует три типа библиотек: ДНК-ориентированные (основанные на ДНК, полученной из иммунных клеток здорового человека), фокусированные (созданные из иммунизированных клеток животных) и синтетические (состоящие из искусственно синтезированных генов).

Преимущества ИФА: высокая чувствительность (метод может обнаруживать одиночные молекулы анализируемого вещества), возможность использования минимальных объёмов исследуемого материала, стабильность всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА при хранении. 

Недостатки иммуноферментного анализа:

1. Необходимость предварительного предположения о природе заболевания. Методика анализа подразумевает, что врач заранее имеет предположение о диагнозе. 

2. Невозможность найти возбудителя и определить его специфичные свойства. В случае диагностики инфекционных заболеваний ИФА лишь указывает на наличие антител в крови у больного, косвенно свидетельствующих о присутствии чужеродного микроорганизма в теле человека. 

3. Возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Причиной недоразумений могут стать технические недочёты, приём медикаментов, который может исказить картину, или нарушение обменных процессов в организме. 

4. Ограниченное количество информации. С помощью ИФА можно определить только наличие или количество молекулы-мишени, но не информацию, связанную с активностью молекулы. 

Заключение: На сегодняшний день существуют десятки модифицированных методов ИФА. Иммуноферментный анализ является наиболее широко используемым твердофазным гетерогенным иммуноферментным анализом ИФА используется для двух целей - для измерения наличия антигенов различных инфекционных агентов, но еще ИФА обычно используется для измерения наличия классов антител (IgA, IgM, IgG) против антигенов различных патогенов.

Методы ИФА постоянно развиваются. С одной стороны, расширяются тест-объекты, с другой - углубляется и совершенствуется сам аналитический метод. Это привело к упрощению схем анализа, сокращению времени анализа и уменьшению расхода реагентов. Также идет постоянный поиск новых ферментов для использования в качестве маркеров; на ИФА все большее влияние оказывают химия полимеров, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняется и технология производства реагентов для ИФА. К сожалению, основное преимущество ИФА, а именно количественное измерение антител, на практике оказывается менее значимым.

Список использованной литературы

1. Основы иммуноанализа : учебное пособие / Н.Е. Максимова, Н.Н. Мочульская, В.В. Емельянов ; под общ. ред. Н.Н. Мочульской ; Министерство науки и высшего образования Российской Федерации, Уральский федеральный университет.— Екатеринбург, 2021

2. Иммунохимические методы в клинической лабораторной диагностике : учебное пособие / С. Г. Марданлы, В. В. Симонов, Т. Ю. Гашенко и др. – Орехово-Зуево : ГГТУ, 2024

3. Коломыткин О. В. Биофизические принципы иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA) [Электронный ресурс]: учебное пособие. / О. В. Коломыткин. – Электрон, текстовые дан. (4,4 Мб). – СПб.: Наукоемкие технологии, 2024

4. Стереоспецифические взаимодействия. Инструментальные и неинструментальные методы в иммуноаналитике [Электронный ресурс] : учебное пособие / П. В. Храмцов, М. Б. Раев, С. А. Заморина ; Пермский государственный национальный исследовательский университет. – Электронные данные. – Пермь, 2020

5. http://virolab.ru/doc/doc25.pdf