XVII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2025

Основная часть

Гнотобионты — это лабораторные животные, выращенные в специальных условиях, полностью изолированных от внешней среды. Их организм либо полностью свободен от микроорганизмов, простейших и паразитов, либо содержит строго контролируемую микрофлору.

Выделяют несколько типов гнотобионтов: безмикробные (монобиоты), полностью лишённые любых микроорганизмов, и гнотоформные животные, в организм которых введены один или несколько видов определённых микробов. Также к гнотобионтам относят животных, свободных от естественных патогенных возбудителей инфекционных и инвазионных заболеваний (SPF-животные, Specific Pathogen Free).

Длительные исследования гнотобионтов выявили ряд анатомо-физиологических особенностей их иммунной системы. Из-за отсутствия антигенного воздействия у таких животных недоразвиты тимус и лимфоидная ткань кишечника, уменьшено количество пейеровых бляшек, CD4+ T-клеток, цитокинов (например, ФНО-α), B-лимфоцитов, продуцирующих IgA [2].

Для безмикробных животных характерны низкие уровни как гуморальных, так и клеточных факторов неспецифической резистентности организма к инфекции (комплемент, лизоцим, пропердин, низкая активность мононуклеарно-фагоцитарной системы) [2]. Воспалительные и микроциркуляторные реакции ослаблены, заживление ран происходит быстрее и без нагноения.

Вследствие всего вышеперечисленного у GF-мышей уменьшается масса внутренних органов, объем циркулирующей крови, понижено содержание воды в тканях. Масса тонкого кишечника составляет треть от нормы. Гнотобионты более восприимчивы к инфекциям - так, при введении минимальной дозы патогенных бактерий E. coli 055, вызывающей у обычных животных незначительную транзиторную бактериемию, у гнотобиотических мышей развивается сепсис, приводящий к их гибели [3].

Митотическая депрессия клеток и пониженная скорость их обновления объясняет повышенную устойчивость гнотобионтов к ионизирующему излучению - злокачественные опухоли возникают реже. Смертность гнотобиотов в 6 раз ниже, чем у обычных животных.

После имплантации стерильным животным представителей нормальной кишечной флоры (лактобацилл, бифидобактерий, энтерококков) у них происходит развитие иммунных структур GALT [1].

Методы получения безмикробных мышей

Для кесарева сечения отбирают здоровых самок на 21-й день беременности, предпочтительно со 2-й или 3-й беременностью [5].

Выделяют два метода:

Гистерэктомия – матку с плодами ампутируют, переносят через стерильный гидрошлюз в изолятор, где извлекают и обрабатывают новорожденных.

Гистеротомия – более совершенный метод, при котором плоды извлекают в изоляторе без контакта с окружающей средой.

Далее новорожденных передают безмикробным или SPF-кормилицам в изоляторе.

Первое поколение GF-мышей не используют в экспериментах из-за возможной трансплацентарной передачи микроорганизмов от матери не являющейся гнотобионтом [10].

Условия выращивания безмикробных животных

Основной элемент гнотобиологической аппаратуры — изоляторы, обеспечивающие надежную защиту от микробов. Они представляют собой герметичные камеры с манипуляционными перчатками, гидро- или аэрошлюзами для стерилизации и безопасного ввода/вывода материалов. Изоляторы оснащены системой стерильного воздухообмена с фильтрацией входящего и выходящего воздуха [2].

Для стерилизации корма, воды и оборудования применяется автоклавный контейнер [5].

Состояние GF-мышей контролируется путем культивирования фекальных образцов на бактерии и грибы, а также ПЦР-анализом 16S для некультивируемых бактерий [10].

Применение безмикробных мышей

Гнотобионты активно используются в иммунологии, вирусологии, микробиологии, патологии, биохимии и других областях биомедицинских исследований [3]. Их ценность заключается в возможности изучения физиологических и патологических процессов без влияния микробного фактора.

Эксперименты на стерильных мышах позволяют глубже изучить роль кишечной микробиоты в развитии иммунной системы и толерантности организма [4].

Мышиные модели широко используются в исследованиях заболеваний человека, так как обладают высокой генетической схожестью с человеком (около 99%). Мыши имеют небольшие размеры, удобны в содержании, быстро размножаются, давая за короткий промежуток времени наблюдать множество поколений, относительно недороги и позволяют проследить влияние микроорганизмов на различные морфологические, физиологические и метаболические процессы [11]. Гнотобионты помогают изучать микробный антагонизм, фагоцитоз и иммунные ответы, патогенез и профилактику инфекций, аутоиммунные заболевания, аллергию, механизмы трансплантационного иммунитета, колонизационную резистентность и эффективность и безопасность пробиотиков [6].

Методы и принципы гнотобиологии позволили использовать в медицине безмикробное пространство, которое способствует более быстрому выздоровлению больных, исключая осложнения и ускорение заживления ран после операции и т. п.

Исследования с гнотобионтами

Опыты на гнотобионтных мышах показали, что именно клостридии играют ключевую роль в поддержании колонизационной резистентности кишечника, в том числе защищают мышей от инфекций Salmonella typhimurium и Citrobacter rodentium [7].

Гнотобионты оказались незаменимыми в дифференциации роли микробных и тканевых факторов в патогенезе ожоговой болезни и понимании природы ожоговой токсемии, где важную роль играют как микробные агенты, так и токсические продукты тканевого происхождения [3].

Особое внимание уделяется изучению рецепторно-сигнальной функции макрофагов с учетом рецепторов распознавания паттернов патогенности и тканевого повреждения, а также расшифровка генетической программы их участия во врожденном и специфическом иммунитете против онкогенов, ВИЧ и других инфекций, а также в воспалительном ответе и поддержании иммунологического и микроэкологического гомеостаза организма на основе взаимодействия с его аутофлорой [3].

Благодаря GF мышам, ранее считавшаяся результатом незрелости иммунной системы, повышенная восприимчивость младенцев к кишечным инфекциям теперь связывается с незрелостью микробиома [8].

Исследования на стерильных животных подтвердили, что отсутствие микробиоты ослабляет врожденный иммунитет, увеличивая восприимчивость к инфекциям, таким как Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae и др. Однако отсутствие микробиоты также усиливает активацию Т-клеток памяти. Эти данные важны для разработки вакцин, например, против холеры [9].

Основные проблемы и будущее гнотобиологии

Как и многие технологии, разработанные в последние десятилетия, технология стерильных мышей продолжает развиваться. Ключевыми проблемами этой области являются нехватка квалифицированных специалистов, а также требования к большому пространству и времени для установки изоляторов. Кроме того, высокие расходы на обслуживание объектов с гнотобиологическими условиями остаются важным препятствием для дальнейшего прогресса.

Дальнейшие углубленные исследования GF мышей с привлечением новейших методов молекулярной биологии помогут раскрыть более тонкие молекулярные механизмы формирования микробиоты и взаимодействия врожденного и приобретенного иммунитета организма хозяина [3].

Примером инновационного подхода может стать создание гуманизированной мышиной модели: мышей GF можно заселить микробиотой кишечника человека, используя редукционистский или холистический подход. В редукционистском подходе изучаются воздействия известных микроорганизмов, а в холистическом — сложная микробиота кишечника от доноров (здоровых или больных) передается мышам, чтобы предсказать её влияние на организм человека через профилирование изменений у реципиентов. Создание «гуманизированных мышиных моделей» может поддержать трансляционные аспекты будущих исследований за счет создания человекоподобных условий в кишечнике мыши [11].

В будущем гнотобиология может найти практическое применение, создавая «персонализированные» гнотобиологические модели для разработки новых типов персонифицированных препаратов, а также для оценки их безопасности и эффективности [6].

Заключение

В данной статье рассмотрены основные достижения использования стерильных мышей в иммунологии и смежных с ней науках. Гнотобионтные модели имеют значительные преимущества в сравнении с другими животными, позволяя глубже понять роль микробов в патогенезе заболеваний, а также исследовать сложные взаимодействия между хозяином и микробами. Гнотобионтный подход открывает новые перспективы для разработки эффективных терапевтических стратегий и более точного изучения биологических процессов живых организмов.

Список литературы

1. Оганезова И.А. Кишечная микробиота и иммунитет: иммуномодулирующие эффекты Lactobacillus rhamnosus GG // РМЖ. — 2018. — № 9. — С. 39–44

2. Подопригора Г. И. Гнотобиология в современных медико-биологических исследованиях / Г. И. Подопригора, Л. И. Кафарская, Н. А. Байнов // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2012. – Т. 67, № 5. – С. 63-70. – DOI 10.15690/vramn.v67i5.277. – EDN OYXWJH.

3. Подопригора Г. И. Микробиотический фактор развития системы мононуклеарных фагоцитов (гнотобиологические исследования) / Г. И. Подопригора // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2013. – Т. 68, № 6. – С. 26-33. – DOI 10.15690/vramn.v68i6.670. – EDN QCVREJ.

4. Айтбаев К. А. Роль кишечной микробиоты в развитии пищевой аллергии. / Айтбаев К. А., Муркамилов И. Т., Муркамилова Ж. А., Фомин В. В. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. — 2021. — № 196(12). — С. 94–101. — DOI: 10.31146/1682-8658-ecg-196-12-94-101.

5. Болотских, Л. А. Усовершенствованный способ получения гнотобиотических животных / Л. А. Болотских, З. С. Лушникова // Биомедицина. – 2005. – № 1. – С. 114-117. – EDN NSPCEH.

6. Шендеров, Б. А. Направления развития гнотобиологии: теоретические и практические аспекты / Б. А. Шендеров // Лечение и профилактика. – 2014. – № 1(9). – С. 80-84. – EDN SDNHWV.

7. Ворошилина Е.С. Фундаментальные основы современных подходов к оценке микробиоты кишечника детей / Ворошилина Е.С., Москвина М.В., Кириллов М.Ю. и др. // Неонатология: новости, мнения, обучение. — 2023. — Т. 11, № 3. — С. 47–59. — DOI: 10.33029/2308-2402-2023-11-3-47-59.

8. Lubin JB, Green J, Maddux S, et al. Arresting microbiome development limits immune system maturation and resistance to infection in mice. // Cell Host Microbe. — 2023. — Vol. 31, No. 4. — P. 554–570.e7. — DOI: 10.1016/j.chom.2023.03.006. — PMID: 36996818; PMCID: PMC10935632.

9. Kubelkova K, Benuchova M, Kozakova H, et al. Gnotobiotic mouse model's contribution to understanding host-pathogen interactions. // Cell Mol Life Sci. — 2016. — Vol. 73, No. 20. — P. 3961–3969. — DOI: 10.1007/s00018-016-2341-8. — PMID: 27544211; PMCID: PMC11108488.

10. Al-Asmakh M, Zadjali F. Use of Germ-Free Animal Models in Microbiota-Related Research. // J Microbiol Biotechnol. — 2015. — Vol. 25, No. 10. — P. 1583–1588. — DOI: 10.4014/jmb.1501.01039. — PMID: 26032361.

11. Jain, A., Maurya, A. Germ-free Mice Technology: Opportunity for Future Research. // In: Tripathi, A.K., Kotak, M. (eds) Gut Microbiome in Neurological Health and Disorders. Nutritional Neurosciences. — Springer, Singapore, 2022. — DOI: 10.1007/978-981-19-4530-4_16