XVII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2025

Актуальность работы.

Измерение концентраций тропонина в сывороткекрови используется для диагностики острого инфаркта миокарда и для исключения тяжелого состояния у пациентов до их выписки из отделения неотложной помощи. Хотя концентрация тропонина не позволяет рано обнаружить начальный (1-2 часа) некроз миокарда, тропонин можно обнаружить примерно через 2-4 часа после повреждения миокарда, поэтому образцы крови рекомендуется брать как при первом обследовании, так и через 6-9 часов, чтобы четко определить наличие инфаркта миокарда. Уровни сыворотки могут оставаться повышенными до 4-7 дней для тропонина I, и 10-14 дней для тропонина Т. Следовательно, тропонин Т остается в кровотоке в течение более длительного периода и может быть использован для диагностики инфаркта миокарда на более поздних стадиях. Функционирование экспресс-тестов дляобнаружения инфаркта миокарда основано на методе иммунохроматографического анализа. В этом процессе 100 мкл крови наносится через специальное приемное окно на полоску для образцов. Белки маркеры, присутствующие в плазме крови, реагируют с моноклональными антителами, помеченными коллоидным золотом, образуя видимые глазу комплексы антиген-антитела. Это позволяет оценить наличие инфаркта миокарда. В промышленном производстве антител для испытаний существует необходимость проверки качества конечного продукта. В результате наличие искусственно синтезированного тропонина Т играет ключевую роль в контроле качества тестов.

Цель работы: Целью проекта является подбор условий для получения рекомбинантного белка тропонина T человека в E.coli.

Задачи работы:

1. ПровеститрансформациюбактерийE.coliRosetta и BL21плазмидойскодирующейпоследовательностьютропонинаТ.

2. Провести синтез с использованием различных бактериальных штаммов и культурных сред, выращивая их в разные периоды времени.

3. Проанализироватьрезультатысинтеза тропонина Тметодом электрофореза вприсутствиидодецилсульфатанатрия.

Описание работы.

Химически компетентные штаммы бактерий E. coli BL21 и Rosetta были трансформироаны вектором peT28a(+)_cTroponinT с применением «теплового шока». Образцы выращивались на чашке Петри, которая содержала LB-агар и канамицин. Бактериальные культуры были инкубированы в термостате в течение 24 часов при 37 ^oC. С целью определения оптимальных условий для синтеза тропонина Т выбрали три различных среды - LB, TB и SOC. Для того, чтобы начать синтез белка, бактериальная культура должна была достичь оптической плотности (OD) 0,4 - 0,6. Перед добавлением индуктора синтеза (IPTG) мы взяли образцы каждой из бактериальных культур. После добавления IPTG пробирки были инкубированы в орбитальном шейкере. Пробы отбирали через 4 и 24 часа Для определения количества синтезированного белка мы использовали электрофореза. Для определения количества белка на геле для последующего сравнения использовли смесь белковых маркеров с известной молекулярной массой. После проведения электрофореза белки в полиакриламидном геле были окрашены Coomassie R-250 и проанализированы.

Результаты работы.

В идентичных условиях штамм BL21 синтезирует меньше белка тропонин T, чем штамм Rosetta. Интересно, что количество белка, синтезированного BL21, практически не зависит от времени инкубации и среды. Наибольшее количество тропонина Т синтезируется при выращивании BL21 в среде SOC после 4 часов инкубации. Что касается штамма Rosetta в среде LB, то количество синтезированного белка остается неизменным вне зависимости от времени инкубации. После 4 часов инкубации в среде TB, количество белка значительно меньше, чем через 24 часа. В SOC-среде время инкубации не влияет на количество синтезированного белка.

Выводы:

Для наиболее выгодного синтеза Тропонина Т в E.coli следует использовать штамм Розетта в SOC среде. Этот метод обеспечивает лучшие результаты за самый короткий промежуток времени.

Список литературы:

1. Ebell, M.H., Flewelling, D., Flynn, C. A. // A systematic review of troponin T and I for diagnosing acute myocardial infarction // J Fam Pract. – 2000. - №49(6). – 550-556.

2. Fathil M.F.M., Arshad M.K. Md, Gopinath Subash C.B., Hashim U., Adzhri R., Ayub R.M., Ruslinda A.R., M. Nuzaihan M.N., Azman A.H., Zaki M., Thean-Hock Tang // Diagnostics on acute myocardial infarction: Cardiac troponin biomarkers // Biosensors and Bioelectronics – 2015. - №70 - 209-220.

3. Bin Wei, Jin J.-P. // Troponin T isoforms and posttranscriptional modifications: Evolution, regulation and function // Archives of Biochemistry and Biophysics – 2011. - №505(2) - 144-154.

4. Marbach, A., Bettenbrock, K. // lac operon induction in Escherichia coli: Systematic comparison of IPTG and TMG induction and influence of the transacetylase LacA. // Journal of Biotechnology. – 2012. – №157(1) – 82-88.

5. Froger, A., Hall, J.E. // Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. // J Vis Exp. – 2007. – №6. – С. 253.

6. Myers, J.A., Curtis, B.S. & Curtis, W.R // Improving accuracy of cell and chromophore concentration measurements using optical density // BMC Biophys. – 2013. - № 6, 4.