XVI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2024
Разработка тест-системы для диагностики вируса африканской чумы свиней методом ПЦР-РВ
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Африканская чума свиней (АЧС) – это особо опасное заразное вирусное заболевание домашних, диких и декоративных свиней, сопровождающееся лихорадкой, угнетенным состоянием, цианозом (то есть посинением) или гиперемией (то есть покраснением) кожи ушей, живота, промежности и хвоста животных, воспалительными и некродистрофическими изменениями паренхиматозных органов, кровянистыми истечениями из носовой полости, клоническими судорогами.
Источником возбудителя являются больные, переболевшие и находящиеся в инкубационном периоде животные, которые могут не иметь клинических признаков.
Передача возбудителя осуществляется через секреты и экскреты зараженных животных, продукты убоя/добычи таких животных и продукты их переработки, трупы свиней и диких кабанов, а также контаминированные возбудителем объекты окружающей среды, включая корма, воду, навоз, подстилку, почву, одежду обслуживающего персонала, оборудование, транспортные и иные материальные и технические средства.
В статье описано создание диагностической тест-системы, основанной на методе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, для идентификации вируса африканской чумы свиней. В качестве основных методов исследования выбраны олигонуклеотидный синтез, анализы генетических последовательностей in silico, ПЦР в режиме реального времени. Ген B646L, кодирующий основной капсидный белок р72, вируса африканской чумы свиней является наиболее консервативной последовательностью. На основе фрагмента последовательности выбранного гена сконструирована диагностическая ПЦР-РВ тест-система. Данная тест-система может быть использована для диагностики вируса африканской чумы свиней в образцах, представляющих из себя буккальный эпителий, кровь, лимфу, ткани пораженных органов.
Введение
Вирус АЧС (African swine fever virus) — вид вирусов, вызывающий африканскую чуму свиней (АЧС), единственный в роде асфивирусов (Asfivirus) и семействе асфаровирусов (Asfarviridae) [1, 2]. Вирусологи относят это семейство к группе крупных ядерно-цитоплазматических ДНК-содержащих вирусов [3, 4, 5, 6].
На рисунке 1 представлены электронные микрофотографии вируса африканской чумы свиней. С помощью разного инструментального увеличения показано многослойное строение вириона на тонких срезах (рис. 1 фрагменты 1 и 3), а также вид частиц при негативном контрастировании (рис. 1.1 фрагменты 2 и 4). В последнем случае хорошо видны многочисленные капсомеры. Поверхностная оболочка вирионов нерегулярна и неплотно связана с подлежащим капсидом (рис. 1 фрагмент 5). На последующих фрагментах рисунка представлены варианты вирусного морфогенеза: прикрепление к клетке (рис. 1 фрагмент 6), почкование и приобретение клеточной оболочки (рис. 1 фрагмент 7), разные формы вирусных частиц - пустая, пентагональная и две гексагональных в разных ракурсах (рис. 1 фрагмент 8), различные морфологические аспекты взаимодействия с клеточной мембраной (рис. 1 фрагменты 9-12). Хорошо видно строение почкующихся вирусных частиц (рис. 1 фрагменты 9 и 12) [7].
Рисунок 1 – Электронные микрофотографии вируса АЧС
Экспериментальная часть
В качестве объектов исследования для создания диагностической тест-системы, основанной на методе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, использовались: положительный контрольный образец, который представлял из себя выделенную ДНК вируса африканской чумы свиней; исследуемые образцы вируса африканской чумы свиней, которые являлись биоматериалом, а именно эпителием исследуемых особей Sus scrofa. Данная работа проводилась в условиях биохимической лаборатории и лаборатории молекулярно-генетических исследований с соблюдением правил санитарных норм, а также правил пожарной и электробезопасности [8].
Для проведения необходимых исследований были использованы:
• Программное обеспечение «MEGA11»;
• Программное обеспечение «ClustalW 2.1»;
• Онлайн-сервис «NCBI»;
• Чашки Петри, изготовленные из пластика;
• Ламинарный бокс с вытяжной вентиляцией;
• Питательная среда «LB»;
• Генетический анализатор «Нанофор 05»; (Синтол, Россия)
• Олигонуклеотидный синтезатор «Polygen 12 column»; (Polygen, Германия)
•Амфлификатор «Bio-Rad CFX 96 Real-Time System»; (Bio-Rad, США)
• Набор для выделения ДНК «ДНК-Сорб-В»; (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия)
•Вектор «pGEM T-Easy Vector System» (Promega, США);
Процесс подбора последовательности для детекции вируса АЧС основывался на положениях, которые приведены ниже.
1. Матрица для детекции вируса африканской чумы свиней должна обладать высокой консервативностью, то есть должна состоять из последовательности, которая наименее подвержена каким-либо изменениям своего состава. Данное свойство матрицы определяет специфичность диагностической ПЦР-РВ тест-системы. Чем выше консервативность взятого для детекции вируса участка, тем больше процент идентификации различных изолятов этого вируса.
2. Матрица должна быть минимально насыщенна гомологичными повторами. То есть, взятая последовательность не должна иметь регулярные повторы нуклеотидов. Это необходимо для облегчения процесса подбора праймеров, так как он, в частности, основывается на температурах их плавления, а гомологичные повторы нуклеотидов либо резко ее поднимают, либо резко понижают.
3. Последовательность выбранной матрицы вируса африканской чумы свиней не должна каким-либо образом пересекаться с последовательностями других вирусов и организмов, поскольку это радикально снижает специфичность работы тест-системы.
Для определения наиболее консервативного участка в гене B646L были отобраны нуклеотидные последовательности белка p72 разных изолятов вируса с использованием сервиса NCBI. Отбор производился по следующим критериям:
• Все исследуемые последовательности изолятов вируса должны соответствовать различным регионам вспышек африканской чумы свиней.
• Изоляты вируса африканской чумы свиней должны быть идентифицированы в различные промежутки времени.
Выдвинутые нами критерии, обозначенные выше, необходимы для того, чтобы можно было точно определить консервативный участок гена B646L у вируса АЧС и использовать его для дальнейшего построения диагностической ПЦР-РВ тест-системы.
Алгоритм ClustalW 2.1 базируется на трех этапах, которые выполняются последовательно:
• Этап парного выравнивания, во время которого происходит попарное сравнение используемых последовательностей относительно друг друга.
• Этап построения филогенетического дерева, во время которого происходит структурное распределение последовательностей.
• Этап множественного выравнивания последовательностей, который основан на анализе ранее построенного филогенетического дерева.
Процесс множественного выравнивания позволяет выявить наиболее консервативные районы среди всех используемых последовательностей изолятов. Наличие таковых является определяющим фактором того, что последовательности обладают определенной функциональной важностью. В данном случае кодируют основной капсидный белок вируса африканской чумы свиней. Опираясь на множественное выравнивание, для определения родства среди всех используемых изолятов вируса АЧС нами было принято решение в дополнительном построении филогенетического дерева. Это необходимо для идентификации такого изолята вируса африканской чумы свиней, последовательность B646L которого являлась бы основополагающей для других изолятов вируса, произошедших от него; или для подтверждения консервативности всех последовательностей [9].
Анализ консенсусной последовательности гена B646L в нашем случае заключался в поиске участка, который соответствовал бы приведенным выше критериям по подбору праймеров. Данный участок в будущем будет использоваться в качестве матрицы для детекции вируса африканской чумы свиней в биологических образцах.
Положительный контрольный образец (ПКО) представляет из себя последовательность, которая включает в себя матрицу-мишень. В нашем случае ПКО включает в себя подобранный ранее участок гена B646L.
Положительный контрольный образец в нашей диагностической ПЦР-РВ тест-системе необходим для того, чтобы можно было гарантировать корректность ее работы. Если при постановке полимеразной цепной реакции нашего ПКО в режиме реального времени будет видна флуоресценция, то можно сделать вывод о том, что праймеры для матрицы-мишени работают исправно. В качестве ПКО для экспериментов в лабораторию был доставлен инактивированный архивный изолят вируса африканской чумы свиней, из которого был выделен необходимый для создания диагностической ПЦР-РВ тест-системы участок гена B646L. Далее этот участок был лигирован в вектор pGEM T-Easy Vector System (США), карта которого представлена на рисунке 2.
Рисунок 2 – Карта вектора pGEM T-Easy
Процесс контроля взятия материала (КВМ) необходим для гарантии, что биоматериал принадлежит необходимому организму, для которого создавалась диагностическая ПЦР-РВ тест-система [10]. В нашем случае КВМ показывает принадлежность доставленного в исследовательскую лабораторию биоматериала к организму Sus scrofa (свинья). Для контроля взятия образца мы использовали последовательность гена, кодирующего цитохром В (CytB) от Sus scrofa, сравнив ее с аналогичными последовательностями соответствующих генов у Equus caballus (лошадь), Bos taurus (бык) и Homo sapiens (человек). Сравнение велось именно с этими организмами, так как чаще всего именно их необходимо диагностировать в присланном образце. Если графики КВМ не будут видны при проведении ПЦР в режиме реального времени, то, продолжая анализ пробы, нельзя говорить о достоверности результатов измерения. Результаты множественного выравнивания по алгоритму ClustalW 2.1 представлены в приложении В. Биоматериал, прибывший в лабораторию, представлял из себя соскоб буккального эпителия от Sus scrofa. Выделение ДНК велось с помощью набора ДНК-Сорб-В. Поставщиком является ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Это стандартный комплект реагентов для выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты из образцов цельной крови, биоптатов, плазмы, фекальных экстрактов, клеточного осадка мочи, слюны, ликвор, мокроты, промывных вод бронхов, бронхо-альвеолярного лаважа.
В ходе экспериментальной части были подобраны: матрица для детекции вируса африканской чумы свиней на основе гена B646L, кодирующего основной капсидный белок p72, и праймеры к ней; матрица для положительного контрольного опыта, представляющая из себя расширенную модель основной детектирующей матрицы и праймеры к ней; матрица для контроля взятия материала, основанная на детекции Цитохрома В Sus scrofa с соответствующими праймерами.
В лабораторию была осуществлена доставка трех проб Sus scrofa, две из которых содержали вирус африканской чумы свиней (ВАЧС), то есть особи были заражены; одна не содержала вирус африканской чумы свиней, то есть особь не была больна. Сам биоматериал представлял из себя буккальный эпителий. Выделение ДНК из проб с помощью набора ДНК-Сорб-В по стандартному протоколу, указанному в инструкции к набору.
Был проведен эксперимент для проверки работоспособности нашей диагностической ПЦР-РВ тест-системы, который заключался в дифференцировке трех образцов. Образцы представляли из себя буккальный эпителий Sus scrofa. Было известно, что два из них несут в себе вирус африканской чумы свиней.
Результаты и их обсуждение
Для определения консервативного участка потенциальной матрицы-мишени p72 (B646L) были отобраны 17 изолятов. При этом данные изоляты вируса африканской чумы свиней были идентифицированы в различные временные промежутки и отличались местом дислокации вспышек заболевания. Список используемых образцов для дальнейшего анализа in silico приведен в таблице 1.
Таблица 1 – Изоляты вируса АЧС
|
№ |
Идентификационный номер изолята вируса с используемым участком |
Место идентификации изолята вируса |
Год идентификации изолята вируса |
Регион идентификации |
|
1 |
MN715134.1 |
Hungary |
2018 |
104575-106512 |
|
2 |
MN172368.1 |
China |
2019 |
103621-105558 |
|
3 |
MK628478.1 |
Lithuania |
2014 |
103617-105554 |
|
4 |
LR722600.1 |
Czech Republic |
2017 |
104580-106517 |
|
5 |
LR722599.1 |
Moldova |
2017 |
104583-106520 |
|
6 |
MK543947.1 |
Belgium |
2018 |
103664-105601 |
|
7 |
MK333180.1 |
China |
2018 |
103621-105558 |
|
8 |
MH910496.1 |
Georgia |
2008 |
103543-105480 |
|
9 |
MH681419.1 |
Poland |
2015 |
103622-105559 |
|
10 |
LS478113.1 |
Estonia |
2014 |
96318-98255 |
|
11 |
OL692744.1 |
India |
2020 |
104790-106727 |
|
12 |
MW049116.1 |
South Korea |
2019 |
104583-106520 |
|
13 |
KJ195685.1 |
Russia |
2012 |
4-1941 |
|
14 |
MW856068.1 |
Malawi |
2019 |
99878-101815 |
|
15 |
MW306192.1 |
Russia |
2019 |
103480-105417 |
|
16 |
MW396979.1 |
Timor-Leste |
2019 |
105394-107331 |
|
17 |
MN172368.1 |
China |
2019 |
103618-105558 |
Процесс определения консервативного участка в потенциальной матрице-мишени р72 (B646L) основывался на множественном выравнивании всех исследуемых последовательностей изолятов вируса АЧС с использованием алгоритма ClustalW 2.1, результаты которого представлены в приложении Б.
Процесс построения филогенетическое дерева осуществлялся с помощью программы MEGA11, который основывался на анализе всех 16 последовательностей вируса африканской чумы свиней. Результат представлен на рисунке 3.
Анализируя результаты филогенетического дерева и множественного выравнивания, можно сделать вывод, что последовательности B646L всех изолятов являются консервативными. Консенсус, то есть последовательность, которая состоит из наиболее часто встречаемых нуклеотидов, в нашем случае не отличается от всех исследуемых in silico изолятов вируса из-за большой консервативности выбранного участка.
Рисунок 3 – Филогенетическое дерево 17 изолятов ВАЧС
Для постановки полимеразной цепной реакции с целью проверки работоспособности диагностической ПЦР-РВ тест-системы из трех присланных образцов были выделены молекулы ДНК. Были подготовлены шесть пробирок со следующим содержимым:
1. Пробирка с образцом 1;
2. Пробирка с образцом 2;
3. Пробирка с образцом 3;
4. Контроль взятия материала (КВМ) для образца 1;
5. Контроль взятия материала (КВМ) для образца 2;
6. Контроль взятия материала (КВМ) для образца 3;
7. Положительный контрольный образец (ПКО);
8. Отрицательный контрольный образец (ОКО).
На рисунке 4 графики под номерами 1 и 4 отражают интенсивность флуоресценции первой пробы и контроль взятия материала для нее соответственно; графики под номером 2 и 5 отражают интенсивность флуоресценции второй пробы и контроль взятия материала для нее соответственно; графики под номерами 3 и 6 отражают интенсивность флуоресценции третьей пробы и контроль взятия материала для нее соответственно; график под номером 7 отражает интенсивность флуоресценции положительного контрольного образца; график под номером 8 отражает интенсивность флуоресценции отрицательного контрольного образца.
Из рисунка 4 следует, что все три контроля взятия материала, соответствующие всем трем образцам, имели интенсивное свечение флуорофора 5FAM. Это свидетельствует о том, что присланные в лабораторию биоматериалы принадлежат организму Sus scrofa. Однако, образец под номером 1 не имел никакого свечения флуорофора, что может означать то, что принадлежащий данной особи материал не несет в себе вирус африканской чумы свиней. То есть, данная особь не заражена. Напротив, образцы под номерами 2 и 3 имели интенсивное свечение, что является подтверждением того, что особи Sus scrofa, которым принадлежал данный биоматериал, больны вирусом африканской чумы свиней. Из рисунка 4 следует, что график положительного контрольного образца (7) имел интенсивное флуоресцентное свечение, которое отсутствовало в отрицательном контрольном образце, опираясь на соответствующий график (8). Это свидетельствует о том, что графики, описанные выше, являются достоверными и диагностическая ПЦР-РВ тест-система позволяет выявлять вирус африканской чумы свиней.
4
7
2, 5
3, 6
8
1
Рисунок 4 – Кривые амплификации
Благодаря выполненному нами подбору необходимых для создания диагностической ПЦР-РВ тест-системы компонентов, осуществлена сборка диагностической системы для детекции вируса африканской чумы свиней. Об успешной работе данной системы можно говорить, опираясь на графики интенсивности флуоресценции, представленные на рисунке 4.
Выводы
-
-
-
-
Проведено изучение современной литературы о эпидемиологической обстановки вируса африканской чумы свиней в России и в мире, строении вируса африканской чумы свиней и о его свойствах.
-
Методом insilico подобраны и обработаны последовательности гена B646L вируса африканской чумы свиней, который запускает экспрессию основного капсидного белка p72; к этим последовательностям выполнен подбор соответствующих праймеров и зондов.
-
Методом твердофазного олигонуклеотидного синтеза синтезированы необходимые для работы диагностической ПЦР-РВ тест-системы праймеры и зонды.
-
Была проведена проверка работоспособности диагностической ПЦР-РВ тест-системы, которая подтвердила наличие в двух положительных присланных в лабораторию биологических образцах буккального эпителия Susscrofaвируса африканской чумы свиней и его отсутствие в одной отрицательной пробе, что подтверждает правильность работы тест-системы.
-
-
-
Литература
-
Макаров, В.В. Глобальная эпизоотология // Российский ветеринарный журнал. – 2019. – № 6. – С. 26 – 35.
-
Корнелюк, А.Д. Обзорная статья на промышленные протоколы автоматизации // Большая студенческая конференция: сборник статей международной научно-практической конференции. – Пермь, 2022. – С. 49-52.
-
Синица, Н.В. Диагностика, лечение, профилактика и меры борьбы с респираторными болезнями молодняка крупного рогатого скота инфекционной этиологии / Н.В. Синицина, П.А. Красочко, Н.И. Гавриченко, В.В. Максимович, П.П. Красочко, Я.П. Яромчик. – Витебск, 2019. – 56 с.
-
Мищенко, А.В. О путях распространения и механизмах передачи вируса чумы мелких жвачных животных / А.В. Мищенко, В.А. Мищенко, В.Н. Шевкопляс, Г.А. Джаилиди, С.Г. Дресвянникова, О.Ю. Черных // Ветеринария Кубани. – 2016. – № 4. – С. 7-9.
-
Ермак, С. С. Африканская чума свиней // Материалы 3 МНПК «Молодежная наука: вызовы и перспективы» – Донбасс, 2020. – С. 60.
-
Гребенникова, Т. В. Диагностика африканской чумы свиней в Российской Федерации / Т.В. Гребенникова, А.Д. Забережный, Т.И. Алипер, О.А. Верховский, Е.А. Непоклонов // Вопросы вирусологии. – 2013. – № 1. – С. 64-79.
-
Макаров, В. В. Природная очаговость африканской чумы свиней: Учебное пособие высших учебных заведений Российской Федерации по образованию в области зоотехнии и ветеринарии / В.В. Макаров, Ф.И. Василевич, Б.В. Боев, О.И. Сухарев – Москва, 2014. – 66 с.
-
Долудин, Ю.В. Сбор и хранение ДНК-содержащего биоматериала и выделенной ДНК / Ю. В. Долудин, А.С. Лимонова, В.А. Козлова, И.А. Ефимова, А.Л. Борисова, А.Н. Мешков, М.С. Покровская, О. М Драпкина // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2020. – Т. 19. – №. 6. – С. 196-204.
-
Бутвиловский, А. В. Выравнивание аминокислотных и нуклеотидных последовательностей / А.В. Бутвиловский, Е.В. Барковский, В.Э. Бутвиловский – Беларусь, 2007. – С. 1-6.
-
Бабий, А. В. Способ контроля взятия биологического материала у крупного рогатого скота при проведении исследований методами полимеразной цепной реакции // Биотехнология: состояние и перспективы развития. – 2015. – С. 211-212.
Design test-system for diagnosing African swine fever virus by method of PCR-RT
©
© Kosarev+ Konstantin Denisovich, Aronova Ekaterina Borisovna, Ginak Anatolyi Iosifovich
1 Higher School of Biotechnology and Food Production.. Institute of Biomedical Systems and Biotechnologies. St. Petersburg Polytechnic University of Peter the Great. Novorossiysk str., 48. St. Petersburg, 194021. Saint-Petersburg. Russia. Tel.: (812) 550-07-17. E-mail: kosarev.kd@gmail.com
___________________________________
*Supervising author; +Corresponding author
Keywords: AFRICAN SWINE FEVER VIRUS, PCR, DIAGNOSTIC TEST-SYSTEM, OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS.
Abstract
African swine fever (ASF) is a particularly dangerous infectious viral disease of domestic, wild and ornamental pigs, accompanied by fever, depression, cyanosis (that is, blueness) or hyperemia (that is, redness) of the skin of the ears, abdomen, perineum and tail of animals, inflammatory and necrodystrophic changes in parenchymal organs, bloody discharge from the nasal cavities, clonic convulsions.
The source of the pathogen are sick, over-ill and in the incubation period animals that may not have clinical signs.
Transmission of the pathogen is carried out through the secrets and excreta of infected animals, products of slaughter/extraction of such animals and products of their processing, corpses of pigs and wild boars, as well as environmental objects contaminated with the pathogen, including feed, water, manure, litter, soil, clothing of service personnel, equipment, transport and other material and technical means.
The article describes the creation of a diagnostic test system based on the real-time polymerase chain reaction method for the identification of the African swine fever virus. Oligonucleotide synthesis, in silico analyses of genetic sequences, and real-time PCR were chosen as the main research methods. The B646L gene encoding the main capsid protein p72 of the African swine fever virus is the most conservative sequence. Based on a fragment of the sequence of the selected gene, a diagnostic PCR-RV test system was constructed. This test system can be used to diagnose the African swine fever virus in samples representing buccal epithelium, blood, lymph, tissues of affected organs.
References
[1] Makarov, V.V. Global epizootology // Russian Veterinary Journal. – 2019. – No. 6. – pp. 26-35.
[2] Kornelyuk, A.D. Review article on industrial automation protocols // Big Student Conference: collection of articles of the international scientific and practical conference. – Perm, 2022. – pp. 49-52.
[3] Sinitsa, N.V. Diagnostics, treatment, prevention and measures to combat respiratory diseases of young cattle of infectious etiology / N.V. Sinitsina, P.A. Krasochko, N.I. Gavrichenko, V.V. Maksimovich, P.P. Krasochko, Ya.P. Yaromchik. – Vitebsk, 2019. – 56 p.
[4] Mishchenko, A.V. On the ways of spreading and mechanisms of transmission of the plague virus of small ruminants / A.V. Mishchenko, V.A. Mishchenko, V.N. Shevkoplyas, G.A. Dzhailidi, S.G. Dresvyannikova, O.Y. Chernykh // Veterinary medicine of Kuban. - 2016. – No. 4. – pp. 7-9.
[5] Ermak, S. S. African swine fever // Materials of 3 MNPK "Youth science: challenges and prospects" – Donbass, 2020. – p. 60.
[6] Grebennikova, T. V. Diagnosis of African swine fever in the Russian Federation / T.V. Grebennikova, A.D. Zaberezhny, T.I. Aliper, O.A. Verkhovsky, E.A. Nepoklonov // Questions of virology. - 2013. – No. 1. – pp. 64-79.
[7] Makarov, V. V. Natural foci of African swine fever: Textbook of higher educational institutions of the Russian Federation on education in the field of animal science and veterinary medicine / V.V. Makarov, F.I. Vasilevich, B.V. Boev, O.I. Sukharev – Moscow, 2014. – 66 p.
[8] Doludin, Yu.V. Collection and storage of DNA-containing biomaterial and isolated DNA / Yu. V. Doludin, A.S. Limonova, V.A. Kozlova, I.A. Efimova, A.L. Borisova, A.N. Meshkov, M.S. Pokrovskaya, O. M. Drapkina // Cardiovascular therapy and prevention. – 2020. – Vol. 19. – No. 6. – pp. 196-204.
[9] Butvilovsky, A.V. Alignment of amino acid and nucleotide sequences / A.V. Butvilovsky, E.V. Barkovsky, V.E. Butvilovsky – Belarus, 2007. – pp. 1-6.
[10] Babiy, A.V. A method for controlling the taking of biological material from cattle during research by polymerase chain reaction methods // Biotechnology: state and prospects of development. - 2015. – pp. 211-212.
Графическое резюме (графический абстракт)
|
.
г. Санкт-Петербург. Россия._________ ©Бутлеровские сообщения. 2022. Т.__. №__._________ 1