XVI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2024

ВВЕДЕНИЕ

Иммуноферментный анализ (далее ИФА) — современное лабораторное исследование, которое ставит своей целью поиск антител в исследуемом материале. Метод основан на регистрации изменений окраски хромогенного субстрата, на который влияет связывание антител или антигенов со специальными ферментами. В клинической диагностике таким образом определяют наличие антител к антигенам микроорганизмов и различным иммунным комплексам.
Для проведения ИФА используется специальный прибор — иммуноферментный фотометр, усовершенствованию которого и посвящена данная работа.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ — лабораторный метод исследования, который позволяет выявить в организме генетически чужеродные вещества. В основе данного метода лежит реакция антиген - антитело.

Антиген — любое вещество, являющееся генетически чужеродным для организма. Иммунная система рассматривает это вещество как потенциально опасное и начинает выработку антител. К антигенам относятся: белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, в том числе и в составе компонентов различных биологических структур (вирусов, бактерий и т.д.), липиды.

Антитела — специальные белки иммуноглобулины, которые вырабатывает иммунная система в ответ на попадание любого чужеродного агента в организм для борьбы с ним. Всего на сегодняшний день выделено 5 классов иммуноглобулинов, которые вырабатываются на разных этапах иммунного ответа. Цель выработки антител — создание прочных комплексов с антигенами, для выведения их из организма.

В лабораторных исследованиях наибольшее распространение получил твердофазный иммуноферментный анализ. При проведении ИФА в качестве твердой фазы используют поверхность лунок полистиролового планшета, на которую адсорбированы входящие в состав тест-системы известные антитела (против определяемого антигена).

В иммуноферментном анализе применяют ферменты, способные связывать антитела или антигены, менять окраску хромогенного субстрата при взаимодействии с ним и могут регистрироваться физико-химическим методом (метод спектрофотометрии, флуориметрический, люминисцентный и др.).

В лунку вносят исследуемую сыворотку крови. При наличии искомого антигена он соединяется с антителом, образуя комплексы. Лунки промывают и удаляют компоненты, которые не связались. В лунки вносят антитела к искомому антигену, меченые ферментом. Меченые антитела присоединяются к предыдущему комплексу и также остаются на стенках. После в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат и хромоген. Если в исследуемой жидкости присутствовал антиген, фермент взаимодействует с субстратом и изменяет его. Продукт реакции взаимодействует с хромогеном и изменяет окраску раствора. По интенсивности окраски можно судить о количестве антигенов.

Аналогично работают тест-системы для определения антител, но в качестве иммуносорбента используется антиген, а раствор, который добавляют, содержит раствор антигенов, меченых ферментом.
В клинической диагностике с помощью фиксированных на твердой фазе антител (антигенов), определяют присутствие антигенов микроорганизмов, антител к ДНК, иммунных комплексов, антигенов раковых клеток, антител к различным видам бактерий, вирусов, простейших.

ИФА применяют в следующих разделах медицины:

• Диагностика вирусных заболеваний: поиск возбудителей гепатитов, герпесвируса, вируса Эпштейн-Барр, цитомегаловируса и др.

• Диагностика инфекций, передающиеся половым путем: хламидиоз, гонорея, трихомониаз, микоплазмоз, уреаплазмоз, сифилис

• Эндокринология (определение уровня гормонов)

• Обнаружение онкомаркеров (диагностика онкологических заболеваний)

• Заболевания сердца. С помощью ИФА можно оценить состояние кардиальных структур, исследуя вещество торопонин-1. Это соединение выделяется при разрушении мышечных тканей, в частности миокарда

• Иммунология (диагностика иммунодефицита, выявление иммунных комплексов и цитокинов)

• Аллергология (диагностика и лечение аллергий, определение общего IgE и специфических IgE антител)

• Выявление лекарственных препаратов, наркотиков в биологических образцах.

Иммунология

В иммунологии ИФА применяют для выявления различных дефектов иммунной системы, называемых иммунопатологиями.

Иммунопатология — неспособность иммунной системы выполнять присущие ей в норме защитные функции. Патология может касаться различных уровней и звеньев иммунной системы.

Нарушения функции иммунной системы могут проявляться в виде:

- гиперфункции, - гипофункции, - дисфункции, - в изменениях толерантности к антигенам.

Использование ИФА применимо в первую очередь для диагностики иммунодефицитных состояний, относящихся к гипофункциям иммунной системы.

Иммунодефицитные состояния — типовые формы патологии системы иммунобиологического надзора, характеризующиеся снижением эффективности или неспособностью иммунной системы организма к осуществлению реакций распознавания, деструкции и элиминации чужеродного антигена, что приводит к снижению защитных возможностей организма перед инфекционными заболеваниями.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) – вирус, разрушающий клетки иммунной системы, которые помогают организму бороться с различными заболеваниями, является наиболее частой причиной возникновения иммунодефицита. Его характерной чертой является гибель разновидности белых кровяных телец крови – CD4-лимфоцитов. Чем больше этих клеток уничтожено вирусом, тем слабее становится иммунная система. Конечным этапом развития ВИЧ является синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД).

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) вызывает инфекционное заболевание, связанное с первичным поражением иммунной системы и развитием ярко выраженного вторичного иммунодефицита, на фоне которого активируется условно-патогенная и непатогенная микрофлора.

Механизм передачи вируса требует обязательного попадания вируса в кровь. Пути передачи: половой, парентеральный через инфицированные препараты крови, загрязненные медицинские инструменты, а также — трансплацентарный.

Патогенез заболевания

Одним из основных механизмов ВИЧ-инфекции является специфическое взаимодействие гликопротеина g 120 оболочки ВИЧ с белком-рецептором CD4, который имеется на поверхности Т-лимфоцитов хелперов-индукторов, а также макрофагов, моноцитов, астроцитов. Кроме хелперного звена поражаются и другие звенья иммунитета, продукция иммуноглобулинов В-клетками, возникает дефицит некоторых компонентов комплемента и т. д.
Поражение иммунитета является причиной развития инфекций условно-патогенными микроорганизмами: Pneumocystis carinii, Herpes symplex, Cryptococcus neoformans, Toxoplasmus gondii, Candida albicans и т.
Диагностика
В лабораторной практике обычно исследуется сыворотка больного для обнаружения АТ к антигенам вируса ВИЧ. Это исследование обычно проводится в 2 этапа: на первом из них при помощи иммуноферментного анализа определяют АТ к вирусным белкам g24, gpl20 и gp41. На втором этапе положительные сыворотки исследуют методом иммуноблоттинга, в котором выделяют антитела против индивидуальных антигенов вируса. При выявлении антител минимум к трем антигенам gp120, gp41, p24 человека считают ВИЧ-инфицированным.

Аллергология

В аллергологии ИФА применяют при использовании метода десинсибилизации, позволяющем лечить реакции гиперчувствительности организма I типа.

Десенсибилизация — метод лечения аллергии, осуществляемый путем регулярного введения в организм больного доз аллергенов в течение нескольких лет.
Метод применяется при диагностированной IgE-зависимой аллергии.
В настоящее время десенсибилизация является единственным методом, который влияет именно на реакцию организма на аллерген, тогда как остальные виды терапии подразумевают под собой симптоматическое лечение.
Проведение десенсибилизации включает следующие этапы:
1. Регулярное ведение в организм постепенно возрастающих доз аллергена до достижения максимальной терапевтической дозы
2. Регулярное введение в организм поддерживающих доз аллергена

Способы введения аллергена:

На данный момент времени практикуется введение аллергенов в организм путем инъекций, перорально, сублингвально и интраназально.
Особых различий в эффективности в зависимости от способа введения аллергена установлено не было. Разница ограничивается вопросом цены и удобства (инъекции — дешевле; пероральное, сублингвальное, интраназальное введение — удобнее).

Основные события, происходящие при десенсибилизации:

1. Выработка «блокирующих» антител класса IgG, которые связывают аллерген, но не вызывают аллергической реакции. Следовательно, уменьшение вероятности встречи IgE с аллергеном

2. Уменьшение уровня IgE

3. Уменьшение содержания в тканях тучных клеток, эозинофилов, нейтрофилов

Возможные результаты метода десенсибилизации:

1. Формирование иммуннологической толерантности к аллергену (реакция на аллерген отсутствует)

2. Снижение чувствительности организма к аллергену (снижается тяжесть симптомов)

Результаты исследований метода десенсибилизации:

Результатом многих исследований метода десенсибилизации являлось временное приобретение испытуемым иммунологической толерантности к аллергену. Однако после прекращения приема поддерживающих доз аллергена и отсутствия его попадания в организм в течение некоторого срока (от нескольких недель до месяцев) при повторном контакте вновь происходило развитие аллергической реакции. Исходя из этого можно сделать вывод о том, что данный метод подразумевает под собой длительный период лечения с неясным сроком, что является существенным недостатком.
В некоторых экспериментах установили, что при более высоких поддерживающих дозах во время лечения, толерантность к аллергену сохранялась дольше, чем в случаях, когда количество вводимого аллергена было меньше.
Стоит также отметить, что результаты метода десенсибилизации довольно разнообразны и несмотря на то, что у некоторых больных после временного перерыва в контакте с аллергеном после лечения реакция организма на него возвращалась, у других испытуемых после такого же по длительности перерыва толерантность к аллергену была сохранена.

Применение иммуноферментного фотометра в методе десенсибилизации:

Во время исследований метода десенсибилизации возможно прослеживание характера изменения содержания в сыворотке крови больного IgG, способного к связыванию с аллергеном, при помощи проведения ИФА. Динамика изменения данного показателя может помочь иммунологам и аллергологам в доработке данного метода, его изучении и коррекции терапии пациентов, так как несмотря на успехи в лечении аллергии, механизм десенсибилизации остается не до конца изученным и не всегда дает ожидаемый результат.

Иммуноферментный фотометр

В медицинской практике для проведения иммуноферментного анализа используются специализированные приборы — иммуноферментные фотометры. По строению ИФ фотометры близки к спектрофотометрам, однако имеют ряд отличий, позволяющих наиболее точно определять концентрацию растворенного вещества, тем самым определить то или иное заболевание.

Принципы работы

Работа ИФ фотометров, как и спектрофотометров основано на поглощении света веществом. При прохождении света через вещество его интенсивность падает согласно закону Бугера — Ламберта — Бера.

, где:

I – интенсивность света в каждой точке поглощающего слоя
I₀ – интенсивность cвета, испускаемого источником.

ε – молярный коэффициент светопоглощения

c – молярная концентрация раствора

l – толщина поглощающего слоя

С помощью детектора устанавливается интенсивность света прошедшего через кювету с исследуемым веществом. Для расчета оптической плотности, меры ослабления прошедшего света прозрачными объектами, используется формула:

, где:
D – оптическая плотность
I – интенсивность света прошедшего через исследуемый раствор
I₀ – интенсивность cвета, испускаемого источником.

Для определения истинной оптической плотности исследуемого раствора используется отношение оптической плотности раствора и растворителя. Таким образом убирается погрешность измерения, связанная с поглощением света растворителем, а также стенками кюветы.

Зная оптическую плотность, концентрация растворенного вещества рассчитывается по формуле:

, где:

D – оптическая плотность

ε – молярный коэффициент светопоглощения

c – молярная концентрация раствора

l – толщина поглощающего слоя

Молярный коэффициент светопоглощения — табличная величина, зависящая от природы вещества и длины волны проходящего света.

Концепция нового спектрофотометра

В настоящее время используются спектрофотометры с использованием классического аппарата оптической схемы. В качестве источника излучения используются лампы накаливания, свет которых проходит через монохроматор, а после попадает на исследуемый образец. Данная схема устройства сопровождается рядом проблем: первое — это пространственная компоновка, источник излучения, во избежание засветки, должен быть вынесен в отдельный отсек, что увеличивает размер прибора. Второе – это доставка света от источника к исследуемому планшету, для этого может быть использована система зеркал или оптоволокно. Каждая из этих систем имеет свои недостатки и преимущества, но в любом случае это уязвимое к повреждениям и износу звено, повышает стоимость прибора.

Мы поставили своей целью избавиться от этих недостатков для создания отечественного бюджетного ИФ фотометра, как для учебных целей, так и для включения его в медицинскую практику.

Конструктивные изменения

Основной идеей нашего проекта является преобразование классической схемы устройства фотометра. Вместо использования ламп в качестве источника света мы предлагаем использовать лазерные диоды, что позволит нам отказаться от большей части оптического аппарата классического фотометра. В частности, мы отказываемся от конденсора и монохроматора. Кроме того, размер диода, а также его узкий направленный пучок излучения позволяет разместить его в измерительном отделении, прямо над планшетом.

Схема устройства

Прибор условно можно разделить на 2 отделения: электротехническое и механико-оптическое.
В электротехническом отделении находится источник питания, блок управления, и другие агрегаты, обрабатывающие информацию из механико-оптического отделения. Наши конструктивные изменения его не касаются, и оно полностью соответствует отделению классической компоновки.

Механико-оптическое отделение содержит весь оптический аппарат прибора, а также планшет для иммуноферментного анализа. Мы предлагаем уместить всё отделение в одном отсеке с предположительным размером 30 х 20 х 20 см. Для проведения ИФА анализа используется 4 фермента, а значит 4 длины волны. Т. к. для каждой длины волны должен использоваться один лазерный диод, мы хотим использовать револьверную головку с четырьмя диодами. Данная головка будет располагаться прямо над планшетом и должна передвигаться по осям x и y. Фотоприемник, располагающийся под планшетом, будет перемещаться вслед за револьверной головкой.
Для удобства установки планшета предлагается сделать выдвижной столик. Он позволит сохранить чистоту механико-оптического отделения при нарушении правил установки. Для технического обслуживания механик-оптического отделения предлагается сделать откидную крышку.
Для вывода данных предлагается использовать присоединяемый монитор и принтер.

Принцип работы

Предлагается использовать два режима работы: программированный и автоматический. Оба этих режима работают по одному принципу:

При проведении анализа считывающая головка поворачивается нужным диодом в фокусную позицию, после чего начинает измерения, начиная с раствора сравнения, записывая все измерения записываются в память компьютера. В дальнейшем происходит последовательное считывание запрограммированных ячеек с перемещением головки и фотоприемника к ним.

Для изменения длины волны излучаемого света головка вместе с фотоприемником возвращаются в исходное положение, после чего происходит поворот головки на 90градусов. И происходит повторное считывание интенсивности пропускания с запрограммированных ячеек.

Однако режимы работы имеют свои отличия:

• Автоматический режим — прибор последовательно проводит измерения всех ячеек всеми длинами волн, при этом в качестве конечного результата прибор будет выдавать минимальную из 4 полученных оптических плотностей, то есть прибор будет сам определять какой какая длина волны оптимальна для конкретной ячейки. Это важно если проводится несколько разных анализов одновременно. Режим экономит время оператора, однако процесс считывания будет проходить дольше.

• Настраиваемый режим — оператор вручную задает какие ячейки какой длиной волны считывать, что увеличивает продолжительность подготовки, но повышает точность работы прибора, а также позволяет считывать не весь планшет.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами была предложена концепция нового иммуноферментного фотометра, который можно производить на отечественных предприятиях для медицинских и учебных целей со следующими преимуществами:

• Два режима программирования работы

• Доступ к техобслуживанию излучателя и фотодиода

• Удобство установки планшета

• Настраиваемая работа позволяет считывать только часть планшета ИФА

• Компактность прибора

• Более надежная оптическая схема

Недостатком, выявленным в ходе разработки, является нехватка отечественных комплектующих: в продаже имеются не все необходимые лазерные диоды. Тем не менее, необходимость производства данного прибора с сугубо отечественными компонентами может стать толчком для развития российской промышленности.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Литусов Н.В. Методы исследования в медицинской бактериологии. Электронное учебное пособие. – Екатеринбург: Изд-во УГМУ, 2021. – 232 с.

2. Л. К. Решетникова Клиническая иммунология: Учеб. пособие - Благовещенск, 1999. - 108 с.: ил., табл.; 21 см.

3. Н.В. Гусакова, Л.А. Мартемьянова Иммунопатологические процессы: учеб.-метод. пособие для студентов медицинских вузов. – Гомель: ГомГМУ, 2019. – 72 с. ISBN

4. Рашид Р., Уметсу Д.Т. Иммунологические механизмы десенсибилизации и толерантности при пищевой аллергии. Semin Immunopathol. 2012 Sep; 34(5): 689-702. doi: 10.1007/s00281-012-0333-9. Epub 2012, 21 июля. PMID: 22821087; PMCID: PMC3744633.

5. Насунова А. Ю. Эффективность различных методов аллерген-специфической иммунотерапии при бронхиальной астме и аллергическом рините, Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук 14.03.09, Москва – 2020

Код для цитирования: Скопировать