XVI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2024

Введение

Клубеньковые бактерии – симбиоты бобовых растений, которые способны связывать атмосферный азот. Благодаря клубеньковым бактериям, бобовые культуры получают необходимое количество азота на протяжении всего периода жизненного цикла (Коць С., Маменко П., 2015). Для каждого вида бобовых растений существуют специфичные штаммы клубеньковых бактерий. Например, специфичными ризобиями для сои, являются бактерии рода Rhizobium вида Bradyrhizobium. Естественный симбиоз бобовых культур и клубеньковых бактерий является безотходным, экономически выгодным и экологически безопасным способом насыщения растений азотом (Жеруков Б., 2010). Для продления жизнеспособности клубеньковых бактерий в промышленных масштабах используются протекторы, способствующие увеличению продолжительности жизни бактерий на семенах (Гришечкин В., 2014).

Соевая культура является одним из важнейших источников растительного белка, имеет большое продовольственное, кормовое и агротехническое значение. (Regar et al. 2017). Благодаря тому, что значительную часть белков сои составляют водорастворимые белки, получение растительного белка из сои наиболее эффективно (Петибская В., 2012). Симбиотические бактерии Bradyrhizobium japonicum отсутствуют на большей части почв территории Российской Федерации. При отсутствии азотфиксирующих бактерий становится невозможным черпать растительный белок из бобовых культур, поэтому необходимы новые технологии обработки семян клубеньковыми бактериями и протравителями для большего выхода белка.

В качестве фунгицидов в данном исследовании используются пестициды класса триазолы, входящие в состав комбинированного протравителя марки «Оплот». В состав протравителей входят токсичные для бактерий вещества, поэтому любые микроорганизмы, в том числе и необходимые для нормального существования растений, подвергаются химическому стрессу при смешивании в растворе. Из-за существования проблемы совместимости протравителей и клубеньковых бактерий целью настоящего исследования явилось изучение интенсивности гибели клеток штамма Bradyrhizobium japonicum H9 под действием пестицида Оплот и влияние протектора на выживаемость клеток.

Объекты и методы исследования

Штамм Bradyrhizobium japonicum H9 был получен из ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ, г. Санкт-Петербург). Посевной материал готовился путём инокуляции изучаемым штаммом полусинтетической питательной среды на основе моносахаридов, дрожжевого экстракта и солей с последующим термостатированием в течение 7 суток при 24°C на качалке при 180 об./мин.

В исследовании использовался фунгицид «Оплот, ВСК» (Дифеноконазол 90 г/л + тебуконазол, 45 г/л, АО Фирма «Август») – контактный системный фунгицид.

Для изучения токсического воздействия пестицидов на клубеньковые бактерии инокулянтов готовили различные варианты рабочих растворов (таб. 1), которые содержали бактериальную культуру, соответствующий биостабилизатор фирмы «ЭКОС Биопрепараты» и химический протравитель в двух концентрациях (полная норма и вдвое меньшая).

Таблица 1 – Варианты рабочих исследуемых растворов

Компоненты рабочих растворов вносили в следующей последовательности: вода, бактериальная культура, защитная добавка, протравитель. После смешивания, образцы растворов встряхивали на вортексе в течение 30 с. Все операции производили в микробиологическом ламинаре.

Смешанные образы хранили при комнатной температуре без доступа УФ. Через определенные интервалы времени (1, 4, 8 часов) делали посевы ряда 10-кратных разведений вариантов растворов на чашки Петри с агаризованной питательной средой. Опыты проводили в трехкратной повторности.

Засеянные чашки Петри помещали в термостат при 30°C, в котором чашки находились 6-7 сут. до момента образования хорошо видимых белых выпуклых слизистых колоний, характерных для клубеньковых бактерий.

Дисперсионный анализ полученных результатов проведён по методике Б. А. Доспехова (2012). Разница по сравнению с контролем в вариантах с применением фунгицидов достоверная, так как превышает значение HCP_0,5.

Результаты и обсуждение

В результате исследований были получены статистические данные по степени устойчивости ризобий к пестициду с течением времени. Полученные данные представлены на рисунке 1 в виде титров бактерий в зависимости от времени, концентрации пестицида в растворе и наличия биостабилизатора.

Рис. 1. Динамика гибели клеток штамма Н9 B. japonicum в растворе с фунгицидом Оплот.

Согласно графику, пестицид Оплот оказывает сильное токсическое влияние на бактерии. С ростом концентрации пестицида в рабочем растворе уменьшается жизнеспособная часть клеток. В течение времени выдерживания уменьшается количество колониеобразующих единиц. Добавление биостабилизатора повышает устойчивость ризобий к химическому воздействию. Самым неэффективным рабочим раствором оказался вариант с полной нормой протравителя. КОЕ*10⁶ в 1 мл рабочего раствора уменьшаются в течение всего эксперимента без резких скачков. Несмотря на стабильность показателей выживаемости, вариант с нормой протравителя является самым неэффективным в промышленных масштабах – наименьший показатель роста спустя 8 часов от начала эксперимента составил 15х10⁶ в 1 мл рабочего раствора.

При снижении нормы протравителя в рабочем растворе в 2 раза наблюдается повышение значений КОЕх10⁶ в 1 мл рабочего раствора в 1 час фиксации данных. Вариант рабочего раствора без биостабилизатора с вдвое меньшей концентрацией пестицида имеет схожие данные с вариантом, в котором присутствует биостабилизатор и полная норма пестицида. Количество клеток на протяжении всего времени сбора данных у обоих образцов различается незначительно в пользу варианта с добавлением биостабилизатора: спустя 8 часов значения вариантов 2 и 3 составили 35х10⁶ КОЕ и 50х10⁶ КОЕ/ 1 мл рабочего раствора, соответственно.

Наибольшие показатели выживаемости клеток исследуемого штамма наблюдаются в варианте 4, в котором вдвое меньшая концентрация пестицида и присутствует биостабилизатор. Согласно полученным данным, в течение всего времени проведения эксперимента показатели варианта выше, чем в других рабочих растворах – 80х10⁶ КОЕ в 1 мл рабочего раствора спустя 8 часов с момента начала сбора данных.

Результаты экспериментальных данных демонстрируют зависимость устойчивости ризобий сои от наличия биостабилизатора в растворе. В растворах, в которых присутствует биостабилизатор, наблюдается большее количество живых клеток (КОЕх10⁶ в 1 мл рабочего раствора) в варианте с вдвое меньшей нормой протравителя. Показательные данные растворов с меньшей нормой фунгицида (80х10⁶ КОЕ в 1 мл рабочего раствора) и нормой (50х10⁶ КОЕ в 1 мл рабочего раствора) говорят о том, что на выживаемость клеток напрямую влияет как наличие защитного биостабилизатора, так и концентрация пестицида в растворе.

Выводы

Таким образом, на основании проведенных экспериментов можно заключить, что исследуемые клубеньковые бактерии Bradyrhizobium japonicum совместимы с пестицидом Оплот. В ходе исследований показано, что токсичность препарата находится в прямой зависимости от окнцентрации и времени воздействия. На повышение выживаемости ризобий влияло добавление защитного биостабилизатора, который эффективно защищал клетки ризобий от химического стресса.

Список литературы / References

1. Коць С., Маменко П. Инокуляция и инкрустация семян сои: обзор технологии применения и рынка препаратов // Спецвыпуск ж. «Пропозиция». – 2015. – С. 24–28.

2. Жеруков Б.Х. Биологический азот в сельском хозяйстве: проблемы, решения и перспективы развития // Известия Горского государственного аграрного университета. – 2010. – Т.47, №2. – С. 43-47.

3. Гришечкин В.В., Головина Е.В. Использование нового органического пленкообразователя (ППО) для сохранения жизнеспособности ризобий при инокуляции семян сои и влияние их на клубенькообразование и урожайность. Зернобобовые и крупяные культуры, 2014, 1(9): С. 41-44.

4. Regar M.K., Meena R.H., Jat G., Mundra S.L. Effect of different rhizobial strains on growth and yield of soybean [Glycine max (L.) Merrill]. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 2017. Vol. 6(11): P. 3653-3659. DOI: 10.20546/ijcmas.2017.611.427.

5. Петибская В. С. Соя: химический состав и использование. – Майкоп: ОАО Полиграф-ЮГ. 2012. C. 30.