Методы определения маркеров индуцированного в эксперименте воспаления - Студенческий научный форум

XV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2023

Методы определения маркеров индуцированного в эксперименте воспаления

Рашимова А.Д. 1, Дегтева Н.М. 1, Мустафаева Г.М. 1, Сириус Версавия Витальевна 1
1ВолгГМУ, МБФ, Биология
 Комментарии
Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

Введение

Воспалительная реакция наступает в течение нескольких минут в ответ на флогогенные агенты и может длиться до нескольких дней, пока патологическое состояние не будет устранено и ткань не восстановится. Этот процесс известен как острая воспалительная реакция, которая контролируется и самоограничивается посредством активации противовоспалительных механизмов для поддержания тканевого гомеостаза.

Если течение воспаления после острого периода приобретает затяжной характер, воспаление становится хроническим.Это состояние длится от нескольких дней до нескольких лет и может быть локальным, ограниченным местом острой реакции, или системным.

Воспалительный процесс включает в себя:

Индукторы воспаления, флогогенные агенты, которые запускают воспалительную реакцию;

Сенсоры, такие как макрофаги, тучные клетки и дендритные клетки, которые стимулируют выработку химических медиаторов в ответ на индукторы;

Медиаторы, среди которых цитокины - являются межклеточными мессенджерами, которые в первую очередь действуют локально на ткани-мишени с очень быстрым ответом;

Ткани-мишени, где медиаторы вызывают воспалительную реакцию до нейтрализации флогогенных факторов.

Медиаторы воспаления включают цитокины, гетерогенную группу полипептидов, белков и гликопротеинов, которые опосредуют клеточную сигнализацию и коммуникацию между клетками иммунной системы, а также между иммунными клетками и другими тканями и органами. В ответ на флогогенные агенты подмножество цитокинов, называемых провоспалительными цитокинами, секретируется различными типами клеток, например, активированными моноцитами/макрофагами, Т-хелперными клетками, и тучными клетками, чтобы вызвать воспаление и активировать врожденные иммунные клетки в очаге воспаления.

При секреции в небольших количествах провоспалительные цитокины действуют локально. При секреции в гораздо больших количествах может произойти “перетекание” цитокинов из воспаленной ткани в систему кровообращения. Как следствие, уровни циркулирующих цитокинов, которые в физиологических условиях находятся в пикомолярном диапазоне, увеличиваются в 1000 раз во время воспалительной реакции [1,2].

Маркеры воспаления

IL-6 является ключевым цитокином при определении острого системного воспаления различного генеза, однако при развитии хронического системного воспаления он в большинстве случаев, доминируя над IL-10, заметно уступает по чувствительности или примерно соответствует TNF-α и IL-8.

IL-10 при остром системном воспалении наряду с IL-6 является ключевым цитокиновым показателем, характеризует противовоспалительное звено системной воспалительной реакции (СВР), его высокие концентрации (> 25 пг/мл) являются критерием тяжести процесса.

К показателям СВР «первого плана» при хроническом системном воспалении из исследованных цитокинов следует отнести TNF-α и IL-8. Эти цитокины у большинства пациентов с патологиями наряду с IL-6 вносят наибольший вклад в формирование интегральных показателей СВР. При остром же варианте системного воспаления ответ со стороны TNF-α даже при критических для жизни состояниях сравнительно невелик. В несколько меньшей степени эта закономерность характерна для IL-8.

В целом по чувствительности для диагностики СВР как при острых, так и при хронических патологиях IL-1β существенно уступает другим исследуемым провоспалительным цитокинам – IL-6, IL-8, TNF-α [3].

Моделирование CFA индуцированного воспаления

Морские свинки считаются более подходящими моделями для изучения различных воспалительных и инфекционных заболеваний человека, чем мыши и крысы. В экспериментальной части используют самок беспородных морских свинок массой 200-250 г (возраст 3-4 недели). Для создания экспериментальных групп животных раствор полного адъюванта Фрейнда (CFA) в количестве 50, 100 или 200 мл вводят под кожу в заднюю лапу в районе стопы. Морским свинкам контрольной группы вводят 200 мкл натрий-фосфатного буфера (PBS). Через 1 день после инъекции CFA, а затем каждые 3–4 дня измеряют ширину дистальной части плюсны обеих задних лап. Измерения ширины дистального района плюсны обеих задних лап показали, что размер задней конечности, в которую вводили CFA, увеличивается в результате развития воспалительной реакции. Реакция в виде отека проявлялась в первый день после инъекции. При этом в группе «200 мкл» отек был сильнее и охватывал почти всю лапу [4, 5].

Метод определения маркеров воспаления

Антитела являются наиболее широко используемым элементом биоопределения в биосенсорике. Тем не менее, были предприняты меры по поиску альтернативных связующих, чтобы преодолеть основные ограничения, связанные с использованием антител. Они могут быть подразделены на аптамеры ДНК/РНК и пептидные аптамеры. Первые представляют собой синтетические олигонуклеотиды, специально полученные и отобранные invitro.

Пептидные аптамеры основаны на относительно небольших, структурно устойчивых белках в качестве каркаса с соединительными петлями. Эти сконструированные каркасы обладают высокой аффинностью и специфичностью, низкой стоимостью производства и небольшим размером, что также придает им длительный срок службы. Более того, высокий контроль за их последовательностью и легкий синтез позволяют разрабатывать специальные модификации, такие как вставка линкера или функциональной группы, которые позволили бы осуществлять контролируемую иммобилизацию на поверхности. Для обнаружения цитокинов без меток использовались оба варианта элементов для биоопределения.

Иммуноферментный анализ (ИФА) - это количественный биохимический метод, который основан на взаимодействии антитело-антиген и колориметрической реакции для определения специфичности анализируемого вещества.Этот анализ остается технологией “золотого стандарта” для обнаружения и количественного определения цитокинов с очень высокой чувствительностью в диапазон концентраций ниже пг/мл для цитокинов, таких как IL-6 (LOD 0,09 пг/мл).

Технология, основанная на проточной цитометрии (например, Luminex) использует лазерный луч и флуоресцентно меченые антитела, проходящие по камере для обнаружения биомаркеров и клеток.

Этот метод появился, чтобы преодолеть ограничение обнаружения одной молекулы, и широко используется в исследованиях с аналогичной чувствительностью, как и ИФА, обнаружение в диапазоне концентраций ниже пг/мл (LOD 0,2 пг/мл для IL-6).

Оба коммерческих метода высокочувствительны и селективны, но они имеют некоторые ограничения: оба требуют много времени, весь процесс занимает 3-8 ч; требуются относительно большие объемы образцов (50-100 мкл на образец для ИФА, а для Luminex требуется только 25-50 мкл для нескольких образцов), но для обоих необходимо специализированное оборудование и персонал, а также флуоресцентная маркировка для обнаружения[4].

Оптические биосенсоры цитокинов, которые основаны на локализованном поверхностном плазмонном резонансе (LSPR), который имеет место, когда электроны зоны проводимости объектов нанометрового размера участвуют в коллективных колебаниях.

Поскольку цитокины являются относительно маленькими белками, нанофотонные биосенсоры доказали свою высокую эффективность в их обнаружении, позволяя обнаруживать множество цитокинов на микрочипе, функционализированном различными антителами, и интегрировать модули культивирования клеток для достижения анализа в режиме реального времени. Другие недавние примеры наноструктурирования включают интеграцию оптических и электрических компонентов.

Это относится к биосенсору IL-1β состоящему из нанопластического блока, интегрированного с микроэлектродами и микрофлюидами, разработанными Song et al.

Электроды, присутствующие в датчике, создают электроосмотический эффект в электролите: электродинамическое перемешивание повышает производительность датчика как с точки зрения времени отклика (5-15 мин), так и с точки зрения высокой чувствительности (1 пг/мл) определения цитокинов в разбавленной сыворотке крови человека.

Цитокины не являются электрохимически активными: следовательно, их можно непосредственно количественно определить с помощью электрохимических средств путем мониторинга изменение реакции окислительно-восстановительного зонда в растворе (обычно пары ферри/ферроцианид калия) при связывании мишени с рабочим электродом, модифицированным специфическим связующим. Электрохимическая импедансная спектроскопия (EIS) на сегодняшний день является наиболее широко используемым электрохимическим методом для обнаружения цитокинов и хемокинов: биосенсоры на основе EIS были продемонстрированы для IL-6, IL-8, IL-1β, TNF-α, IFN-γ, и TGF-β [6].

Вывод

Биосенсеры электрохимического определения биомаркеров воспаления действуют на несколько порядков, охватывая клинически значимый диапазон цитокинов, и демонстрируют низкие пределы обнаружения. Наиболее примечательно, что помимо валидации в буферных тестовых растворах, в большинстве представленных выше работ сообщалось об электрохимическом обнаружении биомаркеров воспаления в более сложных растворах, таких как искусственный пот или даже в реальных биологических образцах, таких как слюна, слезы и сыворотка.

Список литературы

Срослова Г.А., Срослов М.С., Стрыгин А.В., Букатин М.В., Толкачев Б.Е., Морковин Е.И., Колобродова Н.А., Стрыгина А.О., Кузнецова О.Ю., Доценко А.М.и др. Адаптация клеточных элементов, участвующихв регуляции гемостаза, к действию цитокинов (обзор) // Журнал медико-биологических исследований. 2020. Т. 8. № 2. С. 194-203. (дата обращения: 10.12.2022)

Литвицкий П.Ф. Вопросы современной педиатрии // Воспаление. 2006. № 5(3). URL: https://vsp.spr-journal.ru/jour/article/view/736?locale=ru_RU(дата обращения: 02.12.2022).

Гусев Е.Ю., Черешнев В. А., Журавлева Ю. А., Соломатина Л. В., Зубова Т. Э. Варианты развития хронического системного воспаления // Медицинская иммунология. 2009.

№2-3. URL:https://cyberleninka.ru/article/n/varianty-razvitiya-hronicheskogo-sistemnogo-vospaleniya (дата обращения: 10.12.2022).

Дьяченко И.А., Паликов В.А., Паликова Ю.А., Андреев Я.А., Мурашёв А.Н. Новые модели изучения воспалительной активности // Биомедицина. 2015. №3. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/novye-modeli-izucheniya-vospalitelnoy-aktivnosti (дата обращения: 14.12.2022).

Таранов О.С., Якубицкий С.Н., Непомнящих Т.С., Нестеров А.Е., Щелкунов С.Н. Индуцированный адъювантом артрит у морских свинок // Acta Naturae (русскоязычная версия). 2016. №4 (31). URL: https://cyberleninka.ru/article/n/indutsirovannyy-adyuvantom-artrit-u-morskih-svinok (дата обращения: 03.12.2022).

Burtscher B, Manco Urbina PA, Diacci C, Borghi S, Pinti M, Cossarizza A, Salvarani C, Berggren M, Biscarini F, Simon DT, Bortolotti CA. Sensing Inflammation Biomarkers with Electrolyte-Gated Organic Electronic Transistors // Adv Healthc Mater. 2021. №10(20) URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34423579/ (дата обращения: 19.12.2022).

Просмотров работы: 30