МЕТОДЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ И ОЦЕНКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ У МЫШЕЙ

Гальцова Е.А. 1, Раджабова Г.С. 1

1ВолгГМУ

Работа в формате PDF

82.2 KB

Диплом лауреата Диплом руководителя секции

Комментарии

Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

Введение

Актуальность данной темы обусловлена чрезмерной распространенностью аллергических заболеваний по всему миру, как в развитых странах, так и в развивающихся. По данным источника [1] стало известно, что процент страдающих аллергическими заболевания в 2022 году вырос до 35% мирового населения и показатели заболеваемости растут, у каждого третьего может встретиться аллергопатология.

Полной модели аллергических заболеваний человека, рассмотренных на экспериментальных животных, создать не удалось в силу того, что человек имеет генетически сложный антигенный состав тканей и имеет специфические антитела, которые до сих пор не изучены полностью.

Таким образом, улучшение качества диагностики и качества моделирования аллергических заболеваний является и по сей день актуальной проблемой здравоохранения.

Для изучения особенностей патогенеза аллергии используются разные лабораторные животные, и моделирование болезни на животных являются идеальным средством выяснения и изучения механизмов, приводящих к проявлению аллергических реакций.

Мыши являются самыми популярными модельными организмами в изучении аллергических процессов, хотя бы из-за того, что есть возможность вмешиваться в их биологию, а также из-за легкости приобретения ими повышенной чувствительности к аллергенам. Они являются хорошим средством для проверки новых гипотез патогенеза аллергических состояний и подходов к их лечению.

Модели на мышах особенно важны для изучения роли лейкоцитов и связанных с ними цитокинов в развитии аллергического воспаления и легочной дисфункции. Мышей используют для изучения аллергии из-за их небольшого размера, что обеспечивает большую простоту манипуляций, короткое время генерации; относительно низких затрат на покупку и содержание. Кроме того, их короткие сроки беременности и большой размер помета делают грызунов идеальными для экспериментов по разведению и генетических манипуляций. Особенно важно, что геном мыши был полностью секвенирован, это позволило выявить специфические иммунологические механизмы [2].

Методы моделирования аллергических реакций

Моделирование аллергического ринита

Аллергический ринит — аллергическое заболевание слизистой оболочки носа I типа, вызванного причинно-значимым аллергеном, клинически характеризующееся обильной ринореей, зудом в полости носа, повторяющимся чиханием, непроходимостью носовых ходов. Заболевание известно под несколькими названиями, включая аллергический ринит, назальную аллергию, гиперэстетический ринит, назальную гиперчувствительность и поллиноз, которые чаще всего используются в публикациях [3].

Сенсибилизация и стимуляция аллергического ринита овальбумином (OVA)

Назальные вливания осуществляются в процедурном шкафу и перед этим нужно протереть вытяжку и рабочие места дезинфицирующим средством.

Необходимо подготовить две пипетки, каждая из которых заполнена 7,5 мкл соответствующего раствора (аллергена или буфера).

Раствор вводится в две ноздри каждому животному. По завершении инфузии всех мышей убирают и протирают поверхность вытяжки дезинфицирующим средством.

Мышей, подвергшихся хроническому воздействию, обрабатывают в течение 6 недель, либо стерильным 1% раствором OVA (овальбумин), либо раствором PBS (фосфатно-солевой буфер). При 6-недельном воздействии мыши получают инфузии по 5 дней в течение 1 и 2 недель. 3-я неделя – неделя отдыха, без инфузий. За этим следуют однократные двусторонние инфузии в первый день 4-й недели. Затем возобновляют ежедневную инфузию в течение 5 дней 5-й недели и первых 3 дней 6-й недели. Животным вводят однократно двусторонние 7,5 мкл OVA или PBS за 1 день до умерщвления. Затем мышей умерщвляют на четвертый день 6-й недели, через 1 день после последней инфузии.

Применяется ИФА для определения уровней IgE, специфичных для OVA, в сыворотке крови и окрашивание Luna для гистологической верификации носовой эпителиальной эозинофильной инфильтрации. Также рекомендуется изучить морфологию и распределение тканей по всей протяженности носовой полости мыши [4].

Моделирование бронхиальной астмы

Бронхиальная астма определяется как приступообразная и обратимая обструкция дыхательных путей вследствие воспаления и трахеобронхиальной гиперреактивности. Основными симптомами являются кашель с мокротой вязкого стекловидного секрета, а также свистящее дыхание и одышка [5].

Сенсибилизация и стимуляция астмы, вызванной овальбумином (OVA)

Cвежеприготовленный OVA эмульгируют адъювантом и квасцов. Смешать 250 мкл раствора OVA, 100 мкл адъюванта и 650 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) в пробирке для микроцентрифуги объемом 1,5 мл и эмульгировать смесь на вращателе в течение 1 часа при 4 °C.

Каждой мыши на 0-й и 12-й дни вводят внутрибрюшинно 200 мкл смеси OVA, используя шприц объемом 1 мл. Каждая мышь получит дозу в 50 мкг OVA и 0,8 мг гидроксида алюминия. Вводят контрольным мышам 200 мкл раствора PBS.

Мышей нужно заражать на 24, 26 и 28-й дни. Перед заражением разморозить 1 пробирку с 1 мг/мл раствора OVA и разбавить PBS до получения 400 мкг/мл раствора OVA. Перенести предварительно сенсибилизированную мышь в индукционную камеру для ингаляционной анестезии путем испарения смеси изофлурана и кислорода. Извлечь мышь из индукционной камеры, как только частота дыхания замедлится. Удерживая мышь одной рукой, ввести пипеткой 50 мкл 400 мкг/мл OVA интраназально. В каждую мышь вводят по 20 мкг OVA. Контрольным мышам вводят интраназально 50 мкл PBS.

Умертвите мышей для дальнейшей оценки фенотипа астмы, которая происходит на 29-й день, (через 1 день после введения OVA и PBS).

Проверка функции легких

Обезболить мышь смесью ксилазина и кетамина внутрибрюшинно. Разрезать кожу и аккуратно удалить подчелюстную железу, чтобы обнажить трахею.

Через один день после последнего испытания для модели, индуцированной OVA, сопротивление дыхательных путей измеряют у интубированных и вентилируемых мышей путем стимуляции повышающимися концентрациями метахолина (0, 3, 24, и 48 мг/мл в PBS) с использованием аппарата искусственной вентиляции легких с компьютерным управлением.

Эозинофилы являются ключевыми воспалительными клетками, участвующими в патофизиологии астмы. На мышиных моделях астмы аллергическое воспаление дыхательных путей можно оценить путем подсчета общего количества клеток и эозинофилов в бальной жидкости.

Гистология легких

Воспаление легких также можно оценить с помощью гистологии легких. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) используется для окрашивания клеточных и тканевых структур. Периодическое окрашивание кислотой Шиффа (PAS) проводится для выявления гиперсекреции слизи бокаловидными клетками.

Измерение общего и OVA-специфического IgE

Повышенный уровень сывороточного IgE является одним из основных признаков астмы у человека. Уровни общего и OVA-специфического IgE можно определить с помощью твердофазного иммуноферментного анализа [6].

Заключение

Животные и люди имеют много общих важных аллергических заболеваний, и животные оказались ключевыми

чтобы улучшить наше понимание механизмов, задействованных у разных видов, для взаимной выгоды

люди и животные. Животные и люди находятся в одной и той же среде и неразрывно связаны. A

сравнительный подход к медицине позволил нам лучше оценить сходства и различия