В последнее время в сферах исследовательской медицины, фармакологии, био- и нанотехнологий возрастает интерес к методам точечной доставки лекарственных препаратов, визуализации биологических объектов и биоанализа, основанным на применении флуоресцирующих частиц в качестве аналитических меток. Стандартными флуорофорами для биомедицинских исследований являются органические красители, флуоресцентные белки, координационные соединения лантаноидов и т.д. Однако, в настоящий момент они активно вытесняются новыми перспективными наноматериалами – углеродными точками (УТ). УТ завоевали интерес ученых благодаря высокой вариабельности своих оптических свойств, низкой токсичности и простоте получения. Будучи новым классом наноматериалов, УТ изучены не до конца и имеют ряд существенных недостатков, таких как относительно низкие квантовый выход люминесценции и коллоидная стабильность, решение которых позволит ускорить внедрение УТ в практическую биомедицину. В связи с данной проблемой основной целью работы является подбор условий синтеза для получения стабильных высоколюминесцентных углеродных точек.

УТ – это класс наноразмерных углеродных материалов, образованных кристаллическим углеродным ядром, включающим sp² и sp³-гибридизованные атомы углерода, и аморфной оболочкой из различных органических функциональных групп[ CITATION Том \l 1049 \m Том1 \m Его \m АСТ].

Рисунок 1 – Схематичное изображение УТ[CITATION Wan \l 1049 ]

В зависимости от структуры выделяют несколько типов УТ[ CITATION LiS \l 1033 ]:

Графеновые квантовые точки

Углеродные квантовые точки

Углеродные наноточки

Карбонизированные полимерные точки

Механизм люминесценции УТ в настоящее время достоверно не известен, но в литературе принято описывать процессы возникновения вторичного излучения УТ через эффект квантового сопряжения, возникающий, когда размер полупроводникового sp²-домена структуры оказывается меньше определенного значения и электронные уровни энергии переходят из квазинепрерывного в дискретное состояние, образуя энергетический зазор между ВЗМО и НСМО структуры – запрещенную зону (ЗЗ). Электрон в структуре УТ ведет себя как в трехмерной потенциальной “яме” с величиной барьера равной ширине ЗЗ, явно зависящей от размера частицы. При поглощении фотона электрон способен преодолеть этот барьер и релаксировать с излучением вторичного излучения пропорционального по энергии ширине ЗЗ. Таким образом, эмиссионный спектр УТ зависит от их размера. Помимо размера, на максимум люминесценции УТ влияет еще ряд факторов: наличие и природа гетероатомов во внутренней структуре, тип поверхностных функциональных групп. Так, например для повышения энергии ВЗМО необходимо внедрить в структуру УТ электрон-избыточные атомы (N, S, P) или образовать на их поверхности электрон-донорные группы (-OH, -OR, -NH₂), в то время как для снижения энергии НСМО необходимо присутствие в структуре электрон-дефицитных атомов (B) или электрон-акцепторных групп (-NO₂, -COOH). Наличие гетеро-атомов и различных функциональных групп на поверхности УТ зависит от конкретной методики синтеза УТ.

Синтез УТ производится из смеси лимонной кислоты (как основного источника углерода) и мочевины, как азотсодержащей добавки, растворенных в различных растворителях, таких как вода и формамид. На примере данных составов было проведено исследование влияния общей концентрации реагентов в растворе и их взаимного соотношения на характеристики получаемых частиц.

CA:U = 12:1, C_общ = 70 мг/мл, ω_%(N) = 0,6%. Навески 0,14 г лимонной кислоты и 0,0036 г мочевины были растворены в 2 мл бидистиллированной воды и тщательно перемешаны. После раствор был перемещен в микроволновую печь на 10 минут при мощности 1600 W и максимальной температуре 200°С. Результат представлял собой раствор насыщенного желто-оранжевого цвета с сине-зеленой люминесценцией умеренной яркости вблизи источника УФ-излучения 395 нм. Далее образец был профильтрован через мембранный шприцевой фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и очищен диализом через мембрану с пропускной способностью 0,5 кДа в течение 1 суток. На флуориметре снимались 3D-карты зависимости спектра флуоресценции полученных УТ от длины волны возбуждения. По полученным данным можно сказать, что длина волны максимума люминесценции полученных CA-U [H₂O]–УТ слабо зависит от длины волны возбуждающего излучения и находится в диапазоне 425-450 нм. Однако, интенсивность люминесценции на данных длинах волн остается высокой в узком диапазоне энергий возбуждающего излучения и является максимальной при λ_возб = 350 нм. Так же заметно уширение пика и сдвиг максимума люминесценции вплоть до 500 нм при λ_возб > 350, что может быть вызвано наличием в растворе агломератов УТ. Квантовый выход данных УТ составил 6,36%.

Рисунок 2 – Карты зависимости интенсивности флуоресценции от длин волн возбуждения и испускания для CA-U [H₂O]–УТ (0,6% N), полученных микроволновым методом синтеза

Спектры поглощения полученных УТ в своей массе похожи и имеют полосу поглощения 320-340 нм, обусловленную π–π* переходом и доказывающую наличие sp²-гибридных атомов углерода в структуре УТ.

Рисунок 3 – Сопоставление спектров поглощения и флуоресценции CA-U [H₂O]–УТ (0,6% N), полученных микроволновым методом синтеза

Для сопоставления спектров поглощения и люминесценции CA-U [H₂O]–УТ был выбран спектр люминесценции с длиной волны возбуждающего излучения 340 нм, соответствующей полосе поглощения π–π* перехода в структуре УТ.

CA:U = 0,75:1, C_общ = 200 мг/мл, ω_%(N) = 6,8%. Навески 1,45 г лимонной кислоты и 0,6 г мочевины были растворены в 10 мл бидистиллированной воды и тщательно перемешаны. После раствор был перемещен в микроволновую печь на 6 минут при мощности 1600 W и максимальной температуре 200°С. Результат представлял собой раствор насыщенного темно-зеленого цвета с яркой синей люминесценцией вблизи источника УФ-излучения 395 нм. Далее образец был профильтрован через мембранный шприцевой фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и очищен диализом через мембрану с пропускной способностью 0,5 кДа в течение 1 суток.

Длина волны максимума эмиссии, подобно предыдущему рассмотренному составу, не зависит от длины волны возбуждения и равна 450 нм. УТ данного состава имеют узкие и симметричные пики флуоресценции, что тоже может свидетельствовать о меньшем содержании в растворе агломератов с большей длиной волны люминесценции.

Рисунок 4 – Карты зависимости интенсивности флуоресценции от длин волн возбуждения и испускания для CA-U [H₂O]–УТ (6,8% N), полученных микроволновым методом синтеза

Примечательным является наличие в спектре двух полос поглощения на 300 и 375 нм и, соответствующих им двум максимумам по интенсивности люминесценции. Данный феномен требует дальнейшего изучения и предварительно может быть обоснован возникновением новых энергетических электронных состояний, вызванным увеличением вклада орбиталей азота в энергетику структуры. Предположительно благодаря этому фотоны с большей энергией могут поглощаться, вызывая переход электрона в состояния с другой мультиплетностью, не исключено возникновение фосфоресценции. Квантовый выход данных УТ составил 7,58%.

Анализ литературных данных показал, что применение органических азотсодержащих растворителей, таких как формамид и N,N-диметилформамид может способствовать смещению люминесценции УТ в ИК-область. Для исследования влияния формамида на свойства УТ было решено использовать состав CA-U, хорошо зарекомендовавший себя в предшествующих экспериментах. Навески 1,45 г лимонной кислоты и 0,6 г мочевины были растворены в 10 мл формамида и тщательно перемешаны. После раствор был перемещен в микроволновую печь на 6 минут при мощности 1600 W и максимальной температуре 200°С. Результат представлял собой раствор насыщенного бордово-красного цвета с яркой синей люминесценцией вблизи источника УФ-излучения 395 нм. Далее образец был профильтрован через мембранный шприцевой фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и очищен диализом через мембрану с пропускной способностью 0,5 кДа в течение 1 суток.

При рассмотрении спектроскопических данных заметно сильное уширение диапазона λ_возб, при которых интенсивность флуоресценции УТ остается высокой.

Рисунок 5 – Карты зависимости интенсивности флуоресценции от длин волн возбуждения и испускания для CA-U [FA]–УТ (6,8% N), полученных микроволновым методом синтеза

Еще одним отличием от УТ, синтезированных в воде, является заметное смещение максимума люминесценции при изменении λ_возб, вплоть до 550 нм. Все это, в совокупности с асимметричностью пика, позволяет сделать вывод о более высоком коэффициенте полидисперсности системы. Квантовый выход данных УТ составил 5,24%.

Список литературы