XV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2023

Африканская чума свиней (АЧС, восточноафриканская чумка, африканская лихорадка) - высококонтагиозное, остро протекающее вирусное заболевание, характеризующееся ознобом, лихорадкой, цианозом слизистых, кожных покровов, геморрагическими поражениями внутренних органов [3].

Для лабораторных исследований применяют следующие методы: реакцию гемадсорбции (РГАд) в культурах клеток, реакцию прямой иммунофлюоресценции (РПИФ), полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в формате электофорезной детекции, ПЦР в формате реального времени, применяют твёрдофазный иммуноферментный анализ (ТФ – ИФА) (сэндвичвариант). В сомнительных случаях окончательный диагноз устанавливают заражением подозрительным материалом (кровь, суспензия селезенки и лимфатических узлов) свиней, вакцинированных против классической чумы. Серологические типы вируса определяют в реакции преципитации (РП), реакции связывания комплемента (РСК), реакции задержки геамадсорбции (РЗГАд) и другими методами.

Для обнаружения антигена африканской чумы свиней применяют реакцию гемадсорбции (РГАд) в культурах клеток костного мозга (ККМС) или лейкоцитов свиней (ЛС), содержащих эритроциты и последующем обнаружении гемадсорбции ставят в вирусологических лабораториях. Для этого культуру клеток ЛС или ККМС 2-3 суточного возраста, выращенную на стеклянных пластинках из покровных стекол в пробирках (чашках Карреля), заражают экстрактами суспензий органов и кровью и через 24, 48, 72, 96 и 192 часа после инокуляции культуру клеток просматривают под световым микроскопом на наличие гемадсорбции. В положительных случаях наблюдают гемадсорбцию эритроцитов на пораженных вирусом клетках в виде ягоды «малины» [2].

Реакция прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) ставят в вирусологических лабораториях для прямого обнаружения вирусного антигена в клетках органов свиней, подозреваемых в заражении вирусом африканской чумы свиней. Внутриклеточный антиген обнаруживают люминесцентной микроскопией препаратов мазков-отпечатков, окрашенных ФИТЦ-иммуноглобулинами (специфические антитела к вирусу африканской чумы свиней, меченные флуоресцеинизотиацианатом). Лучшими органами для РПИФ являются селезёнка и лимфоузлы. Исследование может быть выполнено в течение 2-4 час.

Оценку результатов микроскопии проводят по условной четырех крестовой шкале при окуляре 10х20-объективе 10. В положительных случаях наблюдают сверкающую, желто-зеленого цвета флуоресценцию клеток с включениями или очаговыми флуоресцирующими комплексами диффузного и гранулярного антигена, в одном из 10-50 полей зрения.

Для обнаружения антигена и антител против вируса африканской чумы свиней применяют твёрдофазный иммуноферментный анализ (ТФ – ИФА) (сэндвич-вариант) основанный на взаимодействии иммобилизированных на поверхности лунок планшет специфических к вирусу АЧС иммуноглобулинов со специфическими антигенами АЧС и последующим выявлением комплекса «антиген-антитело» специфическим к вирусу АЧС конъюгатом антител, меченным пероксидазой хрена (коньюгат ПХ-АЧС). Пероксидаза вызывает разложение находящейся в хромоген-субстратном растворе перекиси водорода и окисление хромогена, в результате чего в лунках развивается окраска субстрата, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству антигена в определяемой пробе. В случае отсутствия антигена, коньюгат ПХАЧС (т.е. ПХ) удаляется отмывочным раствором и окраска отсутствует.

При визуальном учёте реакцию считают положительной при окрашивании хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали исследуемые и специфический антиген в синезеленый цвет и отсутствии окрашивания субстрата в лунках, в которых предварительно инкубировали нормальный антиген [1].

Для обнаружения генома вируса африканской чумы свиней применяют ПЦР в формате электофорезной детекции. Для выполнения используют «Тестсистему для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР» (производство ГНУ ВНИИВВиМ). Принцип реакции заключается в многократном повторении циклов денатурации исследуемой ДНК при температуре 94°С, гибридизации ДНК со специфическими праймерами при температуре 53°С и синтеза с них комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы при температуре 72°С. В результате амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллионы 17 раз, что позволяет визуально учитывать результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле.

Анализ по выявлению вируса АЧС включает выделение ДНК и амплификации специфического фрагмента в полимеразной цепной реакции и электрофорез в агарозном геле.

Результаты электрофореза просматривают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор». Результаты реакции выявляются в виде светящихся полос оранжевого цвета.

Реакция считается положительной, если полоса в соответствующем треке располагается в геле точно на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля амплификации. Размер апликонов после проведения ПЦР- 485 п.н.

Реакция считается отрицательной, если в соответствующих треках полос не обнаружено или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т. е. располагаются на другом расстоянии от старта).

Для обнаружения антигена вируса африканской чумы свиней применяют ПЦР в формате реального времени. Реакции заключается в использовании специфического флюоресцентно-меченного зонда, сайт гибридизации которого лежит между сайтами связывания основных диагностических праймеров. В случае присутствия в исследуемом образце генома возбудителя, зонд будет связываться с его ДНК и прибор регистрирует накопление флуоресцентного сигнала в ходе реакции. Регистрация сигнала происходит через стенки пробирки в режиме реального времени.

Учёт результатов проводят по анализу кривых накопления флуоресцентного сигнала по каналу FAM с помощью программного обеспечения используемого прибора. Положительными считают результаты реакции при значениях Ct, не превышающих 35. Образцы, для которых не определено значение Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию) – результаты считают отрицательными [3].

Наиболее эффективным методом, я считаю, является реакция прямой иммунофлуоросценции. Он отличается относительной специфичностью и быстротой выполнения.

Литературный обзор

1. Апатенко, В.М. Особо опасные вирусные инфекции сельскохозяйственных животных [Текст] учебник // В.М. Апатенко. - К.: Урожай, 2017. - 144с.

2. Апатенко, В.М. Вирусные инфекции сельскохозяйственных животных [Текст] учебник // В.М. Апатенко. - Харьков: ХЗВИ, 2016. - 164с.

3. Vetvo.ru. Африканская чума свиней (АЧС) [Электронный ресурс]: Режим доступа: https://vetvo.ru/afrikanskaya-chuma-svinej-–-do-patogeneza.html - дата обращения 12.01.2023.