XV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2023

Классическая чума свиней (КЧС) – инфекционная высококонтагиозная болезнь, вызываемая РНК-содержащим вирусом, поражающая свиней всех возрастов и характеризующаяся лихорадкой, поражением кровеносной и кроветворной систем, крупозным воспалением легких и крупозно-дифтеритическим воспалением толстого кишечника [3].

Лабораторная диагностика классической чумы свиней (КЧС) основана на:

- обнаружении специфических патолого-гистологических изменений нервных тканей в специально подготовленных срезах;

- обнаружении антигена вируса КЧС реакцией прямой иммунофлуоресцен -ции в клетках мазков – отпечатков проб органов;

- выделении эпизоотического вируса КЧС из патологического материала инокуляцией перевиваемой культуры клеток почки поросенка и его иденти-фикации реакцией прямой иммунофлуоресценции;

- обнаружении специфических антител в сыворотках крови переболевших классической чумой свиней реакцией нейтрализации флуоресцирующих микробляшек;

- выделении и идентификации вируса КЧС биопробой на животных [2].

1. Гистологический метод. Сущность метода заключается в обнаружении специфических патолого-гистологических изменений нервных тканей в специально подготовленных срезах.

Для проведения исследования от павших или убитых свиней берут полушария большого мозга с частями коры, мозжечок, аммоновые рога, спинной мозг в различных участках ствола.

Фиксированные пробы обрабатывают путем подготовки срезов, включенных в парафин или путем подготовки срезов при помощи гистокриотома. Для окрашивания гистологических препаратов используют метод окрашивания гематоксилином. Подготовленные и окрашенные срезы просматривают под микроскопом.

Гистологические изменения, выражающиеся в наличии воспаления, диапедизиальных кровоизлияний, васкулярного эндотелита, мукоидного фирбиозного и гиалинового перерождения стенок сосудов, а также лимфогистиоцитарного энцефаломиэлита в первичной ткани, характерны при заболевании чумой [1].

2. Обнаружение антигена вируса КЧС реакцией прямой иммунофлуоресценции в мазках - отпечатках.

Специфическую флуоресценцию учитывают в лимфоидных клетках паренхимы селезенки, лимфатических узлов, легкого, расположенных группами, а также в эпителиальных клетках миндалин и клетках эпителия почечных канальцев, расположенных группами.

Препараты мазков-отпечатков помещают на капли ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС и выдерживают при (37±0,5)°С в течение 30 мин. Препараты снимают с предметных стекол, ополаскивают ФСБ. После отмывания препараты ополаскивают дистиллированной водой, подсушивают на воздухе и помещают на капли нефлуоресцирующего глицерина, разведенного раствором ФСБ в соотношении 9:1, нанесенные на прозрачные обезжиренные предметные стекла. Края препаратов заливают расплавленным парафином. Проводят люминесцентную микроскопию.

Оценку проводят по условной четырехкрестовой шкале при увеличении 5x40: (++++, +++, ++, +) обнаружение во всех полях зрения множества групп клеток с яркой зеленой цитоплазматической флуоресценцией - результат положительный; (±) обнаружение в 5...10 полях зрения единичных групп, состоящих из 3...5 клеток с зеленой цитоплазматической флуоресценцией - результат сомнительный; отсутствие в мазках-отпечатках клеток с цитоплазматической флуоресценцией. Свечение клеток тускло-зеленое – результат отрицательный. Отдельно расположенные клетки с флуоресценцией цитоплазмы или ядра не учитывают.

3. Выделение эпизоотического вируса КЧС из патологического материала инокуляцией перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК - 15) и идентификация его реакцией прямой иммунофлуоресценции.

Подготовленные для исследования экстракты 20 % - ных суспензий проб органов вносят по 0,5 ...0,6 см в пробирки с культурой клеток РК - 15, выращенной на стеклянных пластинках из покровных стекол, предварительно удалив ростовую среду, потом в термостат на 2 ч. После инуколом удаляют, монослой клеток однократно промывают средой Игла без сыворотки. Затем в пробирки вносят питательную среду и инкубируют. Пластинки извлекают, сушат и фиксриуют холодным ацетоном, проводят люминесцентную микроскопию.

При обнаружении специфической желто - зеленой или зеленой диффузной флуоресценции в цитоплазме клеток, расположенных группами («флуоресцирующие микробляшки»), и отсутствии ее в отрицательных препаратах вирус КЧС считают выделенным и идентифицированным, а результат положительным [2].

4. Постановка реакции нейтрализации флуоресцирующих микробляшек (РНФМ).

Исследуемые сыворотки прогревают при 56 ℃ 50 мин и разводят в пенициллиновых флаконах средой Игла. Во флаконы вносят равный объем 1000 ККИД 50/см5 вируса КЧС, тщательно встряхивают и инкубируют в течение 60 мин в термостате. После этого по 0,5 см³ смеси вносят в пробирки с выращенной культурой клеток РК-15 на стеклянных пластинках, предварительно удалив ростовую среду. Через 2 ч смесь из пробирок удаляют, монослой дважды промывают средой Игла и заливают поддерживающую среду. Затем готовят препараты, ставят реакцию прямой иммунофлуоресценции и микроскопируют люминесцентно.

Результаты начинают оценивать в том случае, если в препаратах, обработанных смесью «нормальная сыворотка — вирус», обнаруживают флуоресцирующие микробляшки при их отсутствии в препаратах, обработанных смесью «специфическая сыворотка — вирус». При отсутствии флуоресцирующих микробляшек в препаратах, обработанных смесью «исследуемая сыворотка — вирус», результат считают положительным, в случае обнаружения — отрицательным.

5. Метод постановки биопробы. Сущность метода заключается в выявлении наличия вируса чумы свиней путем введения восприимчивому животному (свинье) суспензии, полученной из органов, взятых от больных или подозреваемых в заболевании животных.

Для постановки биопробы от больных, павших или убитых животных берут кровь, селезенку, лимфатические узлы, трубчатую длинную кость и делают из них суспензию.

Берут поросят в возрасте 2—3 мес, массой 20—30 кг, восприимчивых к чуме свиней. Животным вводят подкожно по 1 см³ крови или по 2 см³ суспензии органов.

Диагноз на классическую чуму свиней считают положительным:

- если неиммунные поросята, которым был введен исследуемый материал, заболевают, проявляя клинические признаки болезни, и погибают;

- если иммунные поросята, которым введен исследуемый материал, в период наблюдения остаются здоровыми или проявляют незначительные и кратковременные (1—4 дня) клинические признаки болезни слабой интенсивности [1].

Различие этих методов друг от друга в том, что у них разная скорость обнаружения возбудителя КЧС, в точности обнаружения, а также в затратах на реагенты, красители и т.д.

Наиболее эффективным методом, я считаю, является реакция прямой иммунофлуоресценции в мазках – отпечатках. Он отличается относительной специфичностью и быстротой выполнения. Однако во избежание неточностей при использовании этого метода следует иметь в виду, что иммунофлюоресцирующая специфическая сыворотка должна иметь высокие титры антител, она должна быть моновалентной, полученной от свиней, не обработанных другими антигенами; патматериал для исследования должен быть отобран не позже 2-3 ч. после смерти животного, фиксирован в ацетоне или замораживанием и сразу же отправлен на исследование.

Библиографический список

1. ГОСТ 25754-83 (СТ СЭВ 3453-81). Методы лабораторной диагностики классической чумы свиней.

2. Методические указания по лабораторной диагностике классической чумы свиней: утв. Министерством сельского хозяйства РФ от 30 декабря 1996 г. – М. – 285 с.

3. Vetvo.ru. Классическая чума свиней (КЧС) [Электронный ресурс]: Режим доступа: https://vetvo.ru/klassicheskaya-chuma-svinej-kchs.html - дата обращения 06.12.2022.

Код для цитирования: Скопировать