XV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2023

Реакциядиффузионнойпреципитациивгелеосновананаспособностикдиффузиив гелях антител и растворимых антигенов. Диффузией называют проникновения молекул одного вещества между молекулами другого, обусловленные тепловыми движениями молекул [2].

При создании условий, в которых они будут диффундировать навстречу друг другу, при их встрече образуется комплекс антиген + антитело. Этот комплекс не обладает способностью диффундировать в толще агарового геля и выпадает в осадок в виде полосы преципитации, видимой невооруженным глазом. Если же диффундирующие антигены и антитела не гомологичны друг другу, то полосы преципитации не образуется [4].

Метод дифузионной преципитации получил широкое использование. РИД является основным методом диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь, вызываемая вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Лейкозом болеет крупный рогатый скот всех возрастов [3].

Болезнь протекает вначале бессимптомно, затем проявляется персистентным лимфоцитозом и (или) образованием опухолевидных разрастаний в кроветворных и других органах и тканях. Появляются нарушения на молекулярном, клеточном и органном уровнях, что приводит к расстройству кроветворения, увеличению количества лимфоцитов [3].

РИД основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Специфические антитела появляются в крови через 2-8 недель после заражения животного ВЛКРС и сохраняются в организме пожизненно [1].

Серологическому исследованию на лейкоз подвергают животных в возрасте 6 месяцев и старше. Пробы крови для исследований берут не ранее чем через 30 суток после введения животным вакцин и аллергенов, у стельных животных - за 30 суток до отела или через 30 суток после него.

Сыворотки для исследования получают из крови испытуемого животного в количестве 2-3 мл и направляют в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают название хозяйства, номер (кличку), возраст, пол, породу животного [5].

Для постановки РИД используют набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота (ТУ 10-19-442-87), в состав которого входят: сухой специфический антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота, состоящий из гликопротеидного gр-51 и полипептидного р-24 антигенов, разбавитель антигена, специфическая преципитирующая сыворотка (СПС) к вирусу лейкоза, солевая смесь агара (ССА) и разбавитель ССА, контрольные сыворотки: отрицательная, положительная, слабоположительная и положительная с антителами к р-24 антигену ВЛКРС [5].

Оборудование и реактивы:

- чашки Петри диаметром 100 мм;

- стандартный штамп-пробойник для просечения лунок в агаре;

-пипетки пастеровские или автоматические со сменными наконечниками;

-рН-метр;

-осветитель;

- хлорид натрия ;

- дистиллированная вода.

Постановка РИД. Разбавитель ССА и солевую смесь агара переносят в колбу и приливают дистиллированную воду до объема 200 см , затем колбу помещают в водяную баню и выдерживают до полного расплавления гранул агара. Расплавленный агаровый гель, имеющий температуру 50-70°С, разливают слоем 2-3 мм (12-15 мл) в обезжиренные чашки Петри и оставляют их приоткрытыми при комнатной температуре в течение 1 ч. После застывания агара специальным штампом-пробойником делают лунки в геле, не допуская образования трещин между ними и отслоения агара от дна чашки. В каждой чашке делают по четыре фигуры, каждая из которых состоит из семи лунок: одна в центре, остальные по периферии. Диаметр каждой лунки составляет 7 мм, расстояние между центральной и периферическими лунками - 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенных с вакуумным насосом [5].

Антиген, контрольные и испытуемые сыворотки вносят в лунки каждой фигуры пастеровскими или автоматическими пипетками со сменными наконечниками. Антиген (А) вносят в центральную лунку, две диаметрально противоположные лунки заполняют контрольной сывороткой (КС). Оставшиеся в фигуре 4 периферические лунки (1, 2, 3, 4) заполняют испытуемыми сыворотками. Лунки заполняют доверху, не допуская переливания жидкости через край. После заполнения всех лунок чашки Петри закрывают крышками и инкубируют во влажной камере при температуре 22-27°С [5].

Реакцию учитывают не ранее чем через 48 ч и не позднее чем через 96 ч. Чашки просматривают на темном фоне, направляя сфокусированный луч осветителя на дно чашки под углом 30-45°. Специфичность реакции оценивают по контрольной линии преципитата. Если она отсутствует или слабо выражена, то реакцию следует повторить.

Специфическая линия преципитации, формируемая преципитирующей контрольной сывороткой и антигеном, должна быть четкой, иметь форму прямой, располагаться на одинаковом расстоянии от лунок с антигеном и контрольной сывороткой [5].

Неспецифической считают линию преципитации, которая образуется между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном, но не сливается с контрольной линией преципитации, а пересекает ее или упирается в нее, образуя угол [4].

В зависимости от наличия специфических антител против антигенов ВЛКРС в испытуемой сыворотке реакцию оценивают как положительную или отрицательную.

Положительной считают реакцию, если между лунками с антигеном и испытуемой сывороткой образуется полоса преципитации, которая соединяется с полосой преципитации контрольной сыворотки, образуя непрерывную линию, то есть идентична ей:

- если линия преципитации между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном отсутствует, но контрольная линия преципитирующей сыворотки образует вблизи лунки с испытуемой линией изгиб, направленный в сторону лунки с антигеном - слабоположительная сыворотка;

- если контрольная линия значительно укорочена со стороны лунки с испытуемой сывороткой и имеет размытый изгиб к лунке с антигеном или образует линию преципитации, расположенную очень близко от лунки с антигеном - резко положительная сыворотка.

Положительно реагирующая сыворотка может образовывать вторую линию преципитации, которая располагается ближе к лунке с испытуемой сывороткой. Эта линия указывает на наличие в сыворотке преципитирующих антител против второго антигена (р-24) ВЛКРС [5].

Реакцию считают отрицательной, если контрольная линия продолжается до лунки с испытуемой сывороткой без загиба.

В случаях, когда линия преципитации плохо просматривается или имеется зона опалесценции вокруг лунок, реакцию следует переставить.

Сдвиг контрольной линии преципитации в сторону лунки с антигеном или с контрольной сывороткой указывает на нарушение соотношения антигена и антител в тест-системе. В этом случае необходимо использовать другую серию диагностического набора [5].

Животных, сыворотки крови которых дали положительный результат в РИД, признают зараженными вирусом лейкоза, и их необходимо исследовать гематологическим методом.

Основными достоинствами реакции диффузионной преципитации в геле является: простота техники постановки; нетребовательность к чистоте компонентов (можно использовать неочищенный антиген); минимальная потребность в компонентах; возможность документирования результата, путем фотографирования [4].

Недостатки РИД: реакция идет только при наличии сравнительно высокой концентрации специфических антител; при помощи реакции выявляются лишь растворимые и четко преципитирующие антигены; длительность реакции – 48–72 часа [4].

Библиографический список

1. Барышников, П.И. Лабораторная диагностика вирусных болезней животных. / П.И. Барышников, В.В. Разумовская. — Электрон. дан. — Санкт-Петербург: Лань, 2015. — 672 с.

2. Белоусова, Р. В. Ветеринарная вирусология: учебник / Р. В. Белоусова, Э. А. Преображенская, И. В.и Третьякова; Международная ассоциация "Агрообразование" . - М.: КолосС, 2007. - 424 с.

3. Госманов, Р.Г. Ветеринарная вирусология.- 3-е изд., /Госманов Р.Г., Колычев Н.М., Плешакова В.И.- М.: Лань, 2010.- 480 с.

4. Кисленко В.Н, ветеринарная иммунология (теория и практика): учебник / В. Н. Кисленко. - Электрон.дан. - М.: Инфра-М, 2016. - 240 с

5. Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогат ого скота (утв. Минсельхозом РФ 23.08.2000)

Код для цитирования: Скопировать