XV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2023

Ввеедение

В настоящее время научно-исследовательская практика биотестирования представленаширокимспектромметодикииспользуемыхтест-организмов.Тест- объекты (тест-организмы), по определению Л. П. Брагинского – «датчики» сигнальной информации о токсичности среды и заменители сложных химических анализов, позволяющие оперативно констатировать факт токсичности (ядовитости, вредности) среды, независимо от того, обусловлена ли она наличием одного точно определяемого аналитически вещества или целого комплекса аналитически не определяемых веществ[1].

Необычный жизненный цикл рода Дафнии (Daphnia), изучается уже более 150 лет. Большинство видов являются циклическими партеногенами, способными производить два типа яиц, диплоидные партеногенетические яйца или гаплоидные половые яйца, в ответ на сигналы окружающей среды. Определение пола также контролируется окружающей средой; самцы производятся в ответ на подходящие экологические сигналы [3]. Кроме того, род Дафнии (Daphnia) демонстрирует ряд впечатляющих полифенизмов, фенотипических чередований, включая формирование шлема и галстука, в ответ на хищников. Это делает род Дафнии (Daphnia) отличным кандидатом для изучения влияния окружающей среды на эпигенетические программы развития. Самое главное, что в контексте эпигенетики клональные линии генетически идентичны, но состоят из фенотипически расходящихся индивидуумов. Это дает уникальную возможность разделить генетические и эпигенетические влияния на фенотип, что является бесценным активом при изучении эпигенетики. Привлекательность рода Дафнии (Daphnia) как потенциального эпигенетического модельного организма еще больше усиливается тем, что они просты и недороги в обслуживании и имеют быстрый жизненный цикл. В качестве основного потребителя и источника пищи для беспозвоночных и рыб. Таким образом, дафнияявляется экологически важным организмом, хорошо изученным в контексте эволюции, экологии, экотоксикологии, полифенизмов, вызванных хищниками, и геномики и предлагает беспрецедентные возможности для изучения эпигенетики в этих биологически важных процессах [5].

Эпигенетика — это изучение митотически или мейотически наследуемых изменений фенотипов, которые происходят без изменений в последовательности ДНК . Измененная экспрессия генов может быть вызвана метилированием ДНК, модификациями гистонов и интерференцией РНК, а также другими, менее изученными, эпигенетическими механизмами, такими как вариантные гистоны, фазирование нуклеосом, структуры хроматина более высокого порядка и ядерная локализация [6].

Метилирование ДНК, выполняемое либо de novo, либо поддерживающими метилтрансферазами ДНК, было связано с транскрипционной регуляцией, инактивацией хромосом и регуляцией транспонируемых элементов, среди других функций. Метилирование ДНК взаимодействует с другими эпигенетическими процессами. Модификации амино- или карбоксил-концевых хвостов гистонов влияют на взаимодействие гистонов с ДНК, другими гистонами и другими хроматин-ассоциированными белками. Эти модификации выполняются специализированными ферментами и включают ацетилирование, убиквитинирование, сумоилирование, фосфорилирование и метилирование, все из которых могут изменять экспрессию генов [7].

Эпигенетические метки модифицируются внешними факторами окружающей среды, такими как питание и воздействие химических веществ, а также сигналами развития; эти эпигенетические изменения могут повысить способность клетки и организма реагировать на окружающую среду и процветать. Выявление трансгенерационных эффектов , когда эмбрион подвергается развитию в организме матери осуществляется у рода Дафнии (Daphnia). Воздействие факторов окружающей среды на мать может повлиять на потомство либо путем сохранения материнских эпигенетических состояний в клетках зародышевой линии, которые дают начало эмбриону, истинного трансгенерационного эффекта, либо, более просто путем воздействия соматических клеток эмбриона, пока он находится в матери. Чтобы разрешить эту двусмысленность, необходимо контролировать сохранение признака в F3 и последующих поколениях, которые не подвергались воздействию ни как эмбрионы, которые производят F1, ни эмбриональную зародышевую линию, которая производит F2 [5].

Характеристика Daphnia

Род Дафнии (Daphnia)  — род мелких планктонных ракообразных с очень широким географическим распространением.

Род Дафнии (Daphnia) часто встречаются в стоячей пресной воде, от очень маленьких бассейнов до очень больших озер, и хотя они могут колонизировать соленоводные озера или эстуарии, они обычно не колонизируют морскую воду, как это делают некоторые виды родственных родов. Род Дафнии (Daphnia) часто являются ключевым видом в прудах и озерах, где они являются основным основным потребителем, фильтруют мелкие взвешенные частицы, в частности одноклеточные водоросли. Таким образом, они играют важную роль в водных пищевых сетях, сами являясь добычей рыбы или разнообразных беспозвоночных хищников.

Морфология. Тело рода Дафний (Daphnia) овальной формы, сжато с боков, заключено в прозрачный панцирь. Тело нечетко сегментировано на головной, грудной и брюшной отделы. Голова покрыта щитом, передний край которого вытянут, образуя рострум. Под рострумом расположены две пары конечностей: антеннулы и антенны, последние сильно развиты, служат для скачкообразного перемещения в толще воды. Пять пар грудных конечностей сильно расчленены, снабжены щетинками, служат для фильтрации воды, питания, дыхания. Брюшной (абдоминальный) отдел туловища заканчивается постабдоменом, дорсальный край которого имеет выемку, характерную для Дафний (Daphnia) данного вида. В головном отделе, не покрытом раковиной, расположена пара глаз: большой - сложный, маленький - простой. Под панцирем Дафний (Daphnia) легко различимы сердце, кишечник, выводковая камера, которая находится в спинной части туловища. В выводковой камере протекает эмбриональное развитие Дафнии (Daphnia).

Рост. Рост Дафнии (Daphnia) сопровождается линьками, так как увеличение тела возможно только когда хитиновый покров достаточно эластичен. Наиболее интенсивно Дафнии (Daphnia) растут первые дни после рождения, первые три линьки происходят каждые 12 часов. Оптимальное питание обеспечивает удвоение размеров рачков в промежутке между линьками. После наступления половой зрелости рост Дафний (Daphnia) замедляется, снижается и частота линек, линька происходит перед очередной откладкой яиц в выводковую камеру. Всего в течение жизни Дафния (Daphnia) может линять до 24 раз. Размеры Дафний (Daphnia) составляют минимум 0,5 мм (выметанная молодь), максимальные размеры самок - 6,0 мм. Самцы отличаются от самок меньшими размерами (2 - 2,5 мм), видоизмененной формой тела, постабдомена и антеннулы [4].

Развитие. Жизненный цикл начинается, когда самка производит кладку яиц (обычно 6-10), которые выпускаются в ее расплодную камеру, расположенную под ее панцирем. Яйца вылупляются в молодых особей в этой расплодной камере и высвобождаются, когда их мать линяет, как правило, в течение 2-3 дней. Молодые особи, которые уже напоминают взрослых особей, проходят через ряд линьок и звездочек. Самки считаются половозрелыми после развития расплодных мешочков, обычно через 4-6 звездочек, обычно через 6-10 дней. Если условия неблагоприятны или если они были произведены половым путем, яйца будут выпущены в эфиппиум, твердую защитную оболочку, где яйца входят в диапаузу перед вылуплением, когда условия более благоприятны [2].

Репродукция. Род Дафнии (Daphnia) размножаются как бесполым, так и половым путем и имеют циклический партеногенетический жизненный цикл, демонстрируя гетерогонное размножение. При бесполого размножении самки производят диплоидные яйца, которые развиваются в точные клоны; только самки производятся во время циклов бесполого размножения. Однако в неблагоприятных условиях (низкая доступность пищи, перепады температур, высокая плотность популяции) этот вид эми размножается половым путем. Во время полового размножения самцы хватаются за самок, используя свои специализированные вторые усики. Самки производят гаплоидные яйца, которые оплодотворяются самцами и заключены в эфиппию. Эти случаи переносятся на спину самки и отпадают во время ее следующей линьки. Яйца входят в диапаузу и остаются в эфиппии до тех пор, пока условия не станут благоприятными. Половое размножение, как правило, происходит в конце осенних месяцев, а яйца, защищенные эфиппией, обеспечивают всплеск популяции с приходом весны.

Пик яйценоскости приходится на весенние месяцы (апрель и май), но яйца могут быть произведены летом и осенью. В весенние месяцы самка может производить яйца каждые четыре дня; яйца/молодь остаются в выводковых мешочках в течение 2-3 дней. Количество яиц, произведенных за один раз, может составлять от 1 до 100, в среднем 6-10 яиц на расплод. Самка может размножаться до 25 раз на протяжении всей своей жизни, хотя в среднем всего 6 раз.

Самки держат свои яйца и недавно вылупившиеся молодые в своих расплодных камерах в течение нескольких дней, обеспечивая питательные вещества во время развития. После освобождения несовершеннолетних дополнительная родительская опека не осуществляется [3].

Продолжительность жизни. Продолжительность жизни рода Дафнии (Daphnia) сильно зависит от условий окружающей среды, таких как уровень кислорода, доступность пищи и температура. В целом, по мере снижения температуры продолжительность жизни увеличивается, в среднем 40 дней при 25 ° C и 56 дней при 20 ° C. Нестабильные условия окружающей среды, как правило, приводят к сокращению продолжительности жизни. В природе Дафнии (Daphnia) живут в среднем 20 - 25 суток, а в лаборатории при оптимальном режиме 3 - 4 месяца и более.

Питание. Основной пищей для рода Дафнии (Daphnia) служат бактерии и одноклеточные водоросли. Виды, которые переживают зиму в активном состоянии (в глубоких, непромерзающих водоемах), проводят её в придонных слоях воды, питаясь в основном детритом. Питаются путем фильтрации, создавая токи воды ритмическими движениями грудных ножек. Пища отфильтровывается веерами фильтрующих щетинок, которые расположены на эндоподитах III и IV пар грудных ног. Крупные частицы, застрявшие в фильтрационном аппарате (например, нитчатые водоросли), удаляются с помощью постабдомена и его коготков. С фильтрующих вееров пища поступает в брюшной пищевой желобок, передается к максиллам первой пары и затем к мандибулам, движения которых переправляют её в пищевод. Спереди ротовое отверстие Дафниий (Daphnia) прикрыто крупной верхней губой, внутри которой расположены слюнные железы из гигантских полиплоидных клеток. Их секрет склеивает частицы пищи в пищевой комок.

При средней концентрации корма в воде, взрослые Дафнии (Daphnia) различных видов фильтруют со скоростью от 1 до 10 мл/сутки [4].

Дафнии в исследованиях

Использованием рода Дафнии (Daphnia) в качестве предмета экологических исследований и исследований развития, были разработаны многочисленные методы, которые могут в равной степени улучшить ее использование в эпигенетических исследованиях. Были использованы традиционные цитологические методы и совсем недавно они были расширены, чтобы включить флуоресцентную гибридизациюin situ(FISH) [8]. Это может позволить исследовать структуры хроматина более высокого порядка, которые были связаны с эпигенетическим статусом областей генома у других животных. Большое количество генов связано с очень высокой скоростью тандемных событий дупликации генов, и примерно 30% генов уникальны для рода Дафнии (Daphnia) [9]. Наличие последовательности генома позволяет разрабатывать микрочипы для общегеномных транскрипционных исследований [10]. Эмбрионы рода Дафнии (Daphnia) прозрачны и могут развиваться независимо от матери, и в результате эмбриогенездафнийбыл хорошо задокументирован. С доступной геномной последовательностью традиционная эмбриология может быть расширена для изучения конкретных генных продуктов. Методы иммуногибридизацииin situ и иммуногистологии были разработаны таким образом, чтобы можно было исследовать тканеспецифическую и развивающую локализацию РНК и белков [11]. В контексте эпигенетики этот подход может быть использован для обнаружения модификаций гистонов, специфичных для развития и тканей. Хотя в настоящее время для рода Дафнии (Daphnia) нет бессвековеченных клеточных линий, были разработаны методы первичной культуры. Эти клетки жизнеспособны в течение, по крайней мере, одной недели и могут быть преобразованы для изучения роли сверх экспрессии эндогенных или чужеродных генов [12]. Совсем недавно Като и другие показали, что можно вставлять двухцепочечную РНК для снижения экспрессии генов с помощью нокдаунов генов на основе РНКи. Этот же метод может быть использован для чрезмерной экспрессии выбранных генов. Уничтожение специфических генов, кодирующих ДНК-метилтрансферазы, гистон-модифицирующие ферменты и их взаимодействующие белки, позволит оценить роль метилирования ДНК, модификации гистонов и связанных с ними эпигенетических процессов, коррелирующих с четко определенными фенотипами, возникающими в результате эпигенетических изменений [13].

Эпигенетическая регуляция жизненного цикла

Эпигенетические изменения в экспрессии генов могут модифицировать фенотип организма, и эти изменения особенно очевидны, когда нет генетических различий между особями какого-либо одного штамма. Чувствительность эпигенома к сигналам окружающей среды возникает на разных этапах жизненного цикла Дафний (Daphnia).

Производство половых и бесполых яиц обусловлено экологическими факторами окружающей среды, такими как фотопериод, температура, изобилие пищи и скученность [3]. В половых яйцах мейоз является обычным, тогда как бесполые партеногенетические яйцеклетки возникают из абортивного первого мейотического деления, в результате чего диплоидные яйцеклетки способны инициировать развитие при отсутствии оплодотворения [2]. В партеногенетических яйцах первое деление является абортивным; однако многие из тех же мейотических генов экспрессируются в партеногенетическом, что и при половом размножении и образуются биваленты [14]. Тем не менее, гены, подавляющие рекомбинацию, чрезмерно представлены в геноме рода Дафнии (Daphnia) по сравнению с генами, способствующими рекомбинации, хиасматы не наблюдаются и генетических доказательств рекомбинации не наблюдалось. Таким образом, исключая редкие события конверсии, митотической рекомбинации или мутации партеногенетическое потомство генетически идентично. Так как яичник может одновременно содержать партеногенетические и половые яйцеклетки , сигналы должны действовать во время первого мейотического деления, так как образуются ооциты. Как интерпретируются эти сигналы окружающей среды и молекулярный механизм, с помощью которого регулируется мейоз, остается неизвестным. Производство самцов вызвано аналогичными экологическими сигналами, как и половое производство яиц; однако контроль за определением мужского пола не зависит от регуляции женского мейоза. Самцы производятся либо в смешанных, либо, что более типично, полностью мужских выводках и, по крайней мере, у некоторых видов может появиться из оплодотворенных половых эфиппиальных яиц [3]. Несмотря на очевидные морфологические различия — самцы меньше, имеют яички, модифицированные придатки и панцирь — все партеногенетическое потомство, мужское или женское, и их матери, генетически идентичны. Таким образом, механизм определения пола явно является экологическим и эпигенетическим.

Заключение

Род Дафнии (Daphnia) имеет потенциал быть бесценными животными для эпигенетических исследований. Они уже хорошо изучены в контексте их важной экологической и эволюционной роли, а также легко доступны и недороги в обслуживании. Способность рода Дафнии (Daphnia) производить клоны партеногенетически позволяет устранить генетическую изменчивость, ценный ресурс в изучении эпигенетики. Очевидные фенотипические системы анализа позволяют проводить корреляции между такими фенотипическими реакциями и эпигенетическими изменениями, которые их сопровождают [15]. Есть также много классических и молекулярных инструментов, доступных для использования в изучении эпигенетики рода Дафнии (Daphnia).

Следующими действиями в установлении рода Дафнии (Daphnia) в качестве эпигенетического модельного организма будет определение генетических и эпигенетических механизмов, ответственных за установление и поддержание фенотипических реакций на окружающую среду, таких как половое размножение, шлемы и галстуки. Также важно расширить исследования эпигенетических механизмов, включив в них модификации гистонов, РНКI, и дополнительно определить исходные уровни и изменения метилирования ДНК в ответ на стимулы окружающей среды на протяжении всего развития. Документирование эпигенетических различий между половыми и бесполымидафниямии стрессовыми и ненапряженными людьми окажется плодотворной областью исследований с важными последствиями для эволюционной биологии и биологии развития.

Список литературы

1. Брагинский, Л. П. (2000), «Методологические аспекты токсикологического биотестирования на Daphnia magna St. и других ветвистоусых ракообразных (критический обзор)», Гидробилогиче- ский журнал, т. 36, № 5. С.50–70.

2. Ф. Заффаньини, «Репродукция в Дафнии », в Дафнии , Р. Х. Петерс и Р. Де Бернарди, Eds., vol. 45 of Memorie dellIstituto Italiano di Idrobiologia , pp. 245–284, 1987.

3. О. Т. Клейвен,. Ларссон и А. Хобаек, «Половое размножение в Daphnia magna требует трех   стимулов», Oikos , vol. 65, no. 2, pp. 197–206, 1992.

4. ФР.1.39.2001.00283. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний. Федеральный реестр (ФР)"

5. А. Столлеверк, « Водяная блоха Дафния   — «новая» модельная система экологии и эволюции»   Журнал биологии , том 9, No 2, статья 21, 2010.

6. Р. Яниш и А. Берд, «Эпигенетическая регуляция экспрессии генов: как геном интегрирует внутренние и экологические сигналы»,  Nature Genetics , vol. 33, pp. 245–254, 2003.

7. А. Леннартссон и К. Эквалл, «Паттерны модификации гистонов и эпигенетические коды»,  Biochimica et Biophysica Acta , vol. 1790, no. 9, pp. 863–868, 2009.

8. D. Tsuchiya, B. D. Eads, and M. E. Zolan, “Methods for meiotic chromosome preparation, immunofluorescence, and fluorescence in situ hybridization in  Daphnia pulex ,”   Methods in Molecular Biology , vol. 558, pp. 235–249, 2009.

9. J. K. Colbourne, M. E. Pfrender, D. Gilbert et al., "The ecoresponsive genome of Daphnia pulex," Science , vol. 331, no. 6017, pp. 555–561, 2011.

10. A. Soetaert, K. van der Ven, L. N. Moens, T. Vandenbrouck, P. van Remortel, and W. M. De Coen, " Daphnia magna and ecotoxicogenomics: gene expression profiles of the anti-ecdysteroidal fungicide fenarimol using energy-, molting- and life-related cDNA libraries," Chemosphere , vol. 67, no. 1, pp. 60–71, 2007.

11. К. Сагава, Х. Ямагата и Ю. Сига, «Исследование развития эмбриональной зародышевой линии у водяной блохи, Daphnia magna, цинк-пальцевосодержащая VASA в качестве маркера», «Паттерны экспрессии генов, том 5, No 5, стр. 669–678, 2005.

12. C. D. Robinson, S. Lourido, S. P. Whelan, J. L. Dudycha, M. Lynch и S. Isern, "Вирусный трансгенез эмбриональных клеточных культур из пресноводной микрокрустацеевой дафнии",   Journal of Experimental Zoology , vol. 305, no. 1, pp. 62–67, 2006.

13. Y. Kato, K. Kobayashi, H. Watanabe и T. Iguchi, "Экологическое определение пола у ветвиоподового ракообразного Daphnia magna : глубокое сохранение гена Doublesex в пути, определяющем пол",   PLoS Genetics , vol. 7, no. 3, Article ID e1001345, 2011.

14. C. Hiruta, C. Nishida, and S. Tochinai, "Abortive meiosis in the oogenesis of parthenogenetic Daphnia pulex ," Chromosome Research , vol. 18, no. 7, pp. 833–849, 2010.

15. К. К. Сэнфорд, «Влияние температуры на интерсексуальный характер Daphnia longispina»,   Физиологическая зоология , т. 20, с. 325–332, 1947.

Код для цитирования: Скопировать