XV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2023

Культивирование вирусов необходимо для лабораторной диагностики вирусных инфекций, изучения патогенеза и иммунитета при вирусных инфекциях, а также для получения вакцин и диагностических препаратов.

Для осуществления любого биотехнологического процесса необходимы: культура микроорганизмов, питательная среда, аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций, средства контроля и управления.

Основные методы культивирования вирусов: использование культур клеток, куриных эмбрионов, заражение чувствительных лабораторных животных [1,7].

Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Первичную культуру изготавливают из различных органов и тканей человека и животных.

Приготовление первичной культуры клеток складывается из: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост. Первичные культуры клеток чаще культивируют в виде монослоя или на микроносителях.

Перевиваемые культуры – это клетки, способные к размножению вне организма длительное время. Перевиваемые однослойные культуры клеток изготавливают из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях

Отдельные линии перевиваемых культур клеток адаптированы для культивирования в суспензированном состоянии (ВНК-21 (baby hamster kidney; почка новорожденного хомячка), РК-15), хотя большинство из них культивируют в виде монослоя.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых [2,5].

Необходимым компонентом для культивирования клеток является синтетическая питательная среда и сыворотка крови животных. Питательная среда имеет определенный химический состав. Сыворотка создает условия для роста и размножения клеток и вирусов.

Для наращивания клеток для заражения их впоследствии вирусами подходят питательные среды MEM [Eagle, 1959], среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) [Dulbecco & Freeman, 1959] или RPMI 1640 [Moore et al., 1967], в которые добавляется сыворотка.

Cуществуют проблемы, связанные с потенциальной возможностью контаминации сыворотки бактериями, грибами, микоплазмами, вирусами, возбудителями трансмиссивной губчатой энцефалопатии, которые могут попасть в конечный продукт.

В связи с этим в последние годы ведутся активные исследования по конструированию бессывороточных синтетических питательных сред (БС).

Используются смеси сложных сред, таких как среда Хэма F12 [Ham, 1965], с одной из сред, содержащих повышенные концентрации аминокислот и витаминов, таких как DMEM.

Использование БС для культивирования клеток и вирусов позволяет сделать процесс получения вакцин более контролируемым и значительно уменьшить риск контаминации [6,4].

Идеальная БС должна иметь определенный химический состав, поддерживать рост различных видов клеток. Однако универсальной БС не существует. Поэтому для каждого типа клеток разрабатываются специальные среды [4].

Методика культивирования вирусов в культуре клеток сводится к подбору культуры клеток; заражению клеток вируссодержащим материалом, культивированию вируса в клетках с последующей индикацией (обнаружением) вируса в культуре клеток и идентификацией вируса в культуральной жидкости.

Важнейшими параметрами культивирования являются температура, содержание газов, поддерживающих метаболизм клеток и показатель рН культуры.

Оптимальной температурой для культивирования большинства культур клеток является 37ºС, cодержание углекислого газа – 5%, уровень кислотности (рН) среды – 7.2- 7.4;

Cоздание и поддержание необходимых условий культивирования обеспечивается в специальных инкубаторах.

Инкубаторы должны содержать бак, полностью заполненный углекислым газом и открытую емкость с водой для поддержания влажности.

Обеспечение абсолютной стерильности достигается как соблюдением режима работы, так и выполнением необходимых процедур подготовки посуды, питательных сред и инструментов. При работе с посудой, средами и инструментарием необходимо соблюдать правила асептики и антисептики [2].

При промышленном выращивании суспензионных культур применяют биореакторы, в которых процессы глубинного культивирования ведут к увеличению биомассы и синтезу вторичных соединений. Используют только те виды культур, которые обладают способностью размножаться во взвешенном состоянии.

Существуют биореакторы нескольких типов, отличающихся по принципу работы – биореакторы с механическим механизмом перемешивания, газовихревые биореакторы, в которых перемешивание осуществляется за счет воздушного потока, подаваемого через среду, а также комбинированные биореакторы [2].

В биореакторах с механическим перемешиванием воздух подается под давлением через разбрызгиватель (кольцо с множеством маленьких отверстий). При этом образуются мелкие пузырьки воздуха и за счет механического перемешивания (при помощи мешалок) обеспечивается их равномерное распределение.

В барботажных колоннах перемешивание происходит равномерно по всему объему восходящими потоками воздуха, что делает их более экономичными. Отсутствие мешалки предотвращает попадание в среду микроорганизмов [2,5].

Культивирование вирусов на куриных эмбрионах в промышленном производстве используют для получения больших объемов вируссодержащего материала. Таким образом размножаются вирусы гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей, инфекционного ларинготрахеита птиц, чумы плотоядных и.т.д.

Выбор метода определяется тропизмом вируса и целью заражения. Разработано шесть методов заражения эмбрионов.

Заражение в аллантоисную полость, на хорионаллантоисную (ХАО) оболочку, в желточный мешок, в амниотическую полость, в тело зародыша, в кровеносные сосуды ХАО.

Зараженные эмбрионы инкубируют до момента максимального накопления вируса, для каждого вируса и даже штамма эти сроки варьируют от 2 до 7-8 суток [3].

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК:

Зверев В.В. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник: в 2 т. /под ред. В. В. Зверева, М. Н. Бойченко. — 2-е изд., перераб. и доп. — Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2021. — Т. 1. — 448 с.

Корочкин Р.Б. Культивирование вирусов в культурах клеток : учеб.-метод. пособие / Р.Б. Корочкин, А.А. Вербицкий, В.Н. Алешкевич, А.В. Сандул. – Витебск: ВГАВМ, 2010. — 43 с.

Красникова Е.С. Вирусология и биотехнология: краткий курс лекций для студентов 3 курса специальности 36.05.01 Ветеринария /Е.С. Красникова // ФГБОУ ВО Саратовский ГАУ. — Саратов, 2016. — 64 с.

Нечаева Е.А. Бессывороточная питательная среда для культивирования клеток и вирусов/ Е.А.Нечаева, И.Ф. Радаева, Н.Б. Думченко, Т.П. Сумкина, М.П. Богрянцева, Т.Ю. Сенькина: Вестник ПНИПУ. — 2018. — №04. — 97 с.

Сазыкин Ю. О. Учебное пособие для студентов высших фармацевтических учебных заведений. / Ю. О. Сазыкин, С. Н. Орехов, И. И.Чакалева ; под ред. А. В. Катлинского. — 3-е изд., стер. — М.: Издательский центр «Академия», 2008. — 256 с.

Фрешни, Р. Я. Культура животных клеток: Практическое руководство /Фрешни Р.Я., – 4-е изд., испр. и доп. (эл.) – Москва: Лаборатория знаний, 2018. — 791 с.

Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник/В.С. Шевелуха, С 29 Е.А. Калашникова, Е.З. Кочиева и др.; Под ред. B.C. Шевелухи. — 3-е изд.,перераб. и доп.— М.: Высш. шк., 2008.— 710 с.

Код для цитирования: Скопировать