Данио рерио (Danio rerio) как модельный объект в исследовании механизмов регенерации - Студенческий научный форум

XV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2023

Данио рерио (Danio rerio) как модельный объект в исследовании механизмов регенерации

Рашимова А.Д. 1, Дегтева Н.М. 1, Мустафаева Г.М. 1, Сириус Версавия Витальевна 1
1Волгоградский государственный медицинский университет
 Комментарии
Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

Введение

Рыбок Данио Рерио (Danio rerio) долгое время содержали в качестве домашних животных, однако впервые они были использованы в лабораторных исследованиях Джорджем Стрейзингером и его коллегами из Орегонского университета в 1960-х годах. После многих лет работы Стрейзингеру удалось успешно клонировать рыбку, создав первый в истории успешный клон позвоночного.

После этого знаменательного достижения популярность этой модели резко возросла, и теперь она используется в исследованиях широкого спектра заболеваний человека. Помимо этого, рыбка Данио стала ценным модельным объектом для изучения механизмов и процессов регенерации [1].

Рыбки Данио демонстрируют эпиморфную регенерацию, при которой недифференцированная клеточная масса, образовавшаяся после ампутации, способна полностью регенерировать утраченные ткани, такие как кости, сердечная мышца, сетчатка, головной и спинной мозг. Процесс регенерации конечностей у рыб Данио включает в себя несколько стадий, характеризующихся активацией специфических сигнальных путей и экспрессией генов [2].

Данио Рерио удовлетворяет всем требованиям, выдвигаемым к модельным организмам: малые размеры, неприхотливость в уходе, сокращенный во времени жизненный цикл и высокая степень фертильности. Благодаря этим особенностям у Данио Рерио есть все шансы заменить собой лидеров среди модельных организмов: лабораторная мышь (Mus musculus) и серая крыса (Rattus norvegicus). Хотя эволюционно грызуны гораздо ближе к человеку, чем остальные животные, за исключением приматов, использование грызунов в лабораторных экспериментах все более лимитируется международными и национальными комитетами по биоэтике.

Еще одним процессом, изучение которого не может быть в полной мере осуществлено на людях или других млекопитающих, является эмбриогенез. Внутриутробное развитие и ограниченное количество потомства в одном поколении у мышей и крыс делают невозможным проведение целого ряда экспериментов по изучению пролиферации и дифференциации клеток.

Данио Рерио способствует решению и этой задачи, так как способность к наружному оплодотворению, крупная и прозрачная икра в сочетании с простотой и дешевизной выращивания делает эту рыбку незаменимым объектом исследований.

Долгое время считалось, что только беспозвоночные и низшие позвоночные животные могут восстанавливать поврежденные органы, тогда как высшие позвоночные, за исключением рептилий и амфибий, не обладают такой способностью. Неотенические личинки саламандры (axolotl Ambystoma mexicanum), когтистая лягушка (Xenopus levis) и некоторые виды ящериц могут регенерировать хвост, зачатки конечностей, хрусталик глаза и нейроны.

Даже среди организмов, демонстрирующих исключительный регенеративный потенциал, рыбки Данио демонстрируют замечательную способность к восстановлению утраченных структур и высокий потенциал в качестве модели для изучения регенеративной медицины, связанной с сердцем, сетчаткой, кожей и мозгом. Как у эмбриональных, так и у взрослых рыбок Данио, в отличие от большинства амниот, включая птиц и млекопитающих, процесс регенерации происходит без замещения поврежденного участка фиброзной тканью. Отсутствие этого процесса позволяет развивать органы de novo и полностью восстанавливать утраченную функцию сердечной мышцы, глаз, плавников и других важных органов.

Целью данной статьи является обзор достижений современных исследований в области изучения механизмов регенерации и применения Данио Раерио (Danio rerio) в роли модельного объекта.

Основная часть

Морфо-функциональные особенности

Данио Рерио (Danio rerio) маленькая тропическая рыбка семейства карповых (Cyprinidae). Родиной рыбок Данио являются пресноводные водоёмы в Южной Азии, где они встречаются в реках и прудах Индии, Пакистана, Бангладеша, Непала и Бутана.

Средний размер рыбок Данио Рерио составляет 2,5–4 сантиметра. Они имеют длинное торпедообразное, сплющенное по бокам тело, окрашенное в синие и белые полосы, идущие от жабер до хвостового плавника. Два плавника - хвостовой и анальный - полосатые, остальные плавники - прозрачные и не имеют окраски.

У молодых рыб плавники короткие, со временем они отрастают и образуют вуаль (линии с вуалевыми плавниками ). Края плавников могут быть окрашены в жёлтый цвет.

Половой диморфизм у этих рыбок выражен слабо. Основными отличиями является размер тела и брюшко — самки обычно крупнее и имею округлое брюшко. Эта особенность связана со способностью производить икру, которая на прямую завист от размера тела.

Помимо этого, самцы и самки Данио Рерио отличаются своими анальными плавниками. У самок этот плавник имеет закругленные края. У самцов плавник заострен, а его длина меньше, чем у самок.

Полосы на теле самки менее выражены, для них характерна равномерная окраска. В природных условиях беременным самкам приходится прятаться от потенциальных хищников. Такой вид окраски служит им естественной маскировкой. Окраска самцов более насыщенная, с отчётливыми темно-синими полосами.

Рыбки Данио являются хищниками, основной компонент их рациона состоит из зоопланктона, фитопланктона, насекомых и их личинок, в том числе они могут питаться червями и мелкими ракообразными, при условии, что их предпочтительные источники пищи недоступны. Как и другие представители карпообразных, Danio rerio не имеет желудка.

В природе эти тропические рыбки размножаются в сезон муссонных дождей, когда в водоемах появляется больше мелких животных, а вода становится теплее. Обеспеченность пищевыми ресурсами и благоприятные условия биоценоза играют ключевую роль в инициации нереста. Для овуляции и нереста необходимо присутствие самца. Когда брачная пара приближается к нерестилищу, самец начинает бить самку по брюшку хвостовым плавником. Этот процесс приводит к выбросу яйцеклеток и сперматозоидов.

Рыбки Данио обладают высокой плодовитостью, откладывая сотни яиц в каждую кладку. У них также очень короткое время генерации, это сокращает общий экспериментальный процесс и особенно полезно при получении мутантов. После оплодотворения начинается эмбриональное развитие. Оплодотворенные яйца почти сразу становятся прозрачными.

В качестве модельного объекта рыбки Данио обладают многочисленными преимуществами для ученых. Такие характеристики рыбок Данио, как маленький размер, высокая плодовитость, простота и низкая стоимость поддержания популяции, способствуют их широкому использованию в различных областях биологических и биомедицинских наук. Благодаря внешнему оплодотворению и способности полностью регенерировать большинство поврежденных тканей, рыбки Данио широко используются для выявления механизмов, участвующих на ранних этапах эмбриогенеза и регенерации у позвоночных.

Это преимущество перед другими модельными объектами, такими как мыши, которые развиваются внутриутробно и поэтому затрудняют визуальное исследование.

Геном Данио Рерио был полностью секвенирован в 2003 году учёными из Сэнгеровского института, и содержит 26000 генов. По результатам исследования выяснилось, что 70% из них имеют аналоги в геноме человека. Помимо этого, 84% генов Данио Рерио ассоциированы с заболеваниями человека.

Условия выращивания и содержания

Для поддержания аквариумной рыбки рекомендуется использовать высокий прямоугольный аквариум с уровнем воды не более 25 см. Объем емкости должен быть не менее 30 л. Резервуар лучше держать закрытым, поскольку рыбки Данио активно перемещаются в верхнем слое воды и могут выпрыгнуть. В период спаривания самцы и самки иногда переносятся в емкость меньшего размера с высотой водной толщи 6–8 см. Оптимальная температура воды для Данио должна составлять около 24°С. Более низкие или высокие температуры могут снизить продолжительность жизни, способность к размножению и количество жизнеспособных эмбрионов. Оптимальный pH подбирается в интервале 6,5–7,5.

Поддержание чистоты аквариума и фильтров для воды являются очень важными для здоровья популяции рыбок. Стоячий водоем требует постоянной очистки. Для того, чтобы предотвратить застойные явления, предусмотрен специальный насос. Необходимый уровень растворенного кислорода поддерживается на отметке 6,0 мг/л.

Данио Рерио относится к социальным животным и содержать их рекомендуется группами из 5-6 особей. Важно, чтобы на каждого самца приходилось по паре самок. Danio rerio питается сухим кормом. Однако даже коммерческий, высококачественный сухой корм недостаточен для нормальных условий содержания рыбок. Поэтому необходимы некоторые пищевые добавки, включающие замороженные или живые подкормки. Среди наиболее популярных подкормок можно назвать личинки Artemia nauplii, Artemia salina, Tubifex tubifex, Drosophila melanogaster и Daphnia. Добавление искусственных растений, имитирующих природные условия обитания, позволяет рыбкам чувствовать себя комфортно и безопасно. Дно аквариума можно засыпать гранитным щебнем, песком и мелкой галькой [3].

Современные направления.

Повреждение тканей может полностью разрешиться путем регенерации или может привести к необратимому рубцеванию и потере функции. Реакция на повреждение тканей различается в зависимости от самой ткани и вида организма. Определение естественных механизмов регенерации у модельных организмов, которые хорошо регенерируют, может помочь в создании стратегии восстановления тканей у организмов с низким регенеративным потенциалом, главным образом у людей

Для изучения механизмов регенерации используются различные виды травм: физические (резекция, колющие, криоповреждения), а также генетические процедуры для удаления определенного типа клеток.

Выбор подходящей модели травмы и стадии развития организма зависит от вида повреждений, которые предполагается имитировать, особенно если основная цель состоит в том, чтобы создать модель состояния человека. Не всегда возможно смоделировать патологическое состояние человека по причине различия его морфо-функциональных характеристик с модельным объектом. 

Ткани и органы человека можно разделить в соответствии с их регенеративным потенциалом на три группы: как органы с высокой регенеративной способностью (кровь и кожа); со средней регенеративной способностью (кости, печень и скелетные мышцы); и с низкими регенеративным потенциалом (нервная система, сердечная мышца и конечности), которые не способны восстановить потерянную клеточную массу. Из-за этого, любой дегенеративный процесс, происходящий в третьей группе органов приводит к серьезным патологическим состояниям или летальному исходу.

Данио РериоDanio rerio ) — один из самыхдоступных модельных объектов позвоночных для изучения регенерации.

Для большинства исследований используются взрослые особи, в некоторых случаях изучение регенерации органов можно проводить на личинках.

В настоящее время ученые сосредоточены на выявлении механизмов, ответственных за восстановление нормального функционирования поврежденных клеток, тканей и органов у млекопитающих.

Регенерация плавников

Одним из наиболее распространенных оперативных методов является резекция тканей. Этот метод обычно используется для плавника и сердца. Danio rerio является идеальным объектом для изучения эпиморфического типа регенерации конечностей, при котором утраченная часть тела восстанавливается с помощью пролиферации недифференцированных стволовых клеток.

После ампутации плавников первым шагом к регенерации является развитие эпидермального колпачка, который закрывает рану. Под ней образуется бластема, её образование происходит за счет процессов пролиферации и дедифференцировки мезенхимальных клеток под эпидермальным колпачком, что приводит к образованию новой ткани плавников.

Клетки бластемы подразделяется на проксимальные и дистальные в зависимости от скорости пролиферации и экспрессии генов. Регенеративный рост начинается на 5-6 сутки после травматизма, для которого характерна активная пролиферация проксимальных клеток бластемы. Проксимальная часть начинает дифференцироваться в складку плавника и приобретает пигментацию. По истечении трех недель плавник полностью регенерирует [4].

Регенерация сердечно-сосудистой системы

В сердце первым шагом к регенерации после резекции желудочка является образование кровяного сгустка, позже замещающегося фибриновым сгустком, за которым следует de novo рост для замены утраченной ткани, пока поврежденный миокард не станет почти неотличимым от окружающей ткани.

Другим популярным хирургическим методом повреждения является криотравма, которая часто используется для сердца. В этом методе ткань подвергается воздействию переохлажденного металла, который эффективно убивает клетки при контакте. Регенеративный процесс в сердце начинается с замещения некротизированной ткани фибробластами, отлагающими внеклеточный матрикс. Впоследствии преходящая рубцовая ткань регрессирует и замещается новой сердечной тканью. 

Было установлено, что внеклеточный матрикс является основным фактором, инициирующим органогенез и регенерацию. Во время эмбриогенеза матрикс запускает процесс пролиферации и созревания всех типов клеток сердечно-сосудистой системы. Ядро внеклеточного матрикса формирует белок фибронектин, который играет роль субстрата для мигрирующих во время регенерации кардиомиоцитов [5].

Вследствие инфаркта наблюдается суперэкспрессия генов, ответственных за синтез фибронектина. У Danio rerio при запуске процесса регенерации молекулы фибронектина полностью распадаются. Однако у млекопитающих, в том числе и у людей, механизм деградации этого белка нарушен, что останавливает процесс регенерации и приводит к фиброзу тканей. Изучение экспрессии генов, ответственных за оба процесса — и регенерации и последующего распада фибронектина — помогает понять и контролировать механизмы восстановления кардиомиоцитов млекопитающих.

Тем не менее есть данные о том, что регенерация органов может проходить частично. 

Даже при условии отсутствия рубца после восстановления морфологии сердца, движение стенки желудочка в регенерированной области остается частично нарушенным и сокращается асинхронно с остальной частью сердца даже после полной регенерации ткани. Таким образом, необходимо различать морфологическую и функциональную регенерацию. В таком случае, даже в таком модельном объекте, как рыбки Данио, регенерация может быть функционально несовершенной [6].

Нейрорегенерация

Нанесение колющих травм, обычно применяется для повреждения центральной нервной системы, в том числе спинного мозга. В этом случае за накоплением и пролиферацией глиальных клеток в области повреждения следует пролиферация клеток-предшественников, которые в конечном итоге дифференцируются в новую нервную ткань.

Данио Рерио является оптимальным организмом для исследований тонких молекулярно-генетических и клеточных механизмов патогенеза нейродегенеративных заболеваний, двигательных и психических расстройств, а также нарушений в органах чувств человека.

Это обусловлено большим количеством зон нейрогенеза в мозге рыбок Данио. У взрослых особей млекопитающих существуют лишь две основные зоны нейрогенеза – субвентрикулярная расположенная в боковых желудочках, в которых новые нейроны образуются и мигрируют далее в обонятельную луковицу, чтобы трансформироваться в интернейроны, и субгранулярная в зубчатой извилине гиппокампа [9].

В отличие от млекопитающих, у которых пролиферативный процесс носит глиальный характер и превалирует в зоне поражения, у рыбок Данио преобладает пролиферация в нейрогенных зонах, откуда нейрональные предшественники впоследствии мигрируют в зону поражения.

Ранние исследования показали, что субвентрикулярная зона отвечает за активацию регенеративных процессов после серьезных повреждений головного мозга, производя клетки-предшественники, которые активно делятся и мигрируют к поврежденной области, затем подвергаются дифференцировке и интеграции с имеющимися нервными структурами.

Заключение

Регенерация тканей позволяет восстановить функцию поврежденных тканей и органов. Млекопитающие проявляют очень низкую склонность к регенерации, хотя некоторые органы обладают высокой восстановительной способностью. Другие системы, такие как центральная нервная система, не восстанавливаются у млекопитающих, и травмы или заболевания ЦНС обычно приводят к непоправимым повреждениям.

Danio rerio обладает большим потенциалом во всех областях современной биологии и по праву занимает место одного из самых перспективных модельных объектов среди других организмов. Однако ввиду того, что до сих пор не учтены все особенности анатомии, морфологии и физиологии этой тропической рыбки, ученым предстоит изучить более детально все преимущества использования Danio rerio для последующих масштабных практических целей.

На сегодняшний день не хватает знаний о том, какие клеточные популяции становятся активными во время регенерации и все ли клетки обладают одинаковым регенеративным потенциалом. Чтобы ответить на многие из этих вопросов, некоторые молекулярные инструменты, такие как условное редактирование генома, необходимо будет улучшить и широко использовать для исследований регенерации. Благодаря этим новым технологическим достижениям, безусловно, будут сделаны важные открытия в отношении механизмов регенерации органов с использованием модели рыбок Данио Рерио. Улучшение знания о механизмах регенерации органов у таких видов, как рыбки Данио с врожденной способностью к регенерации, могут послужить источником вдохновения для разработки терапевтических стратегий у млекопитающих.

Список литературы:

Khan, F. R. Current Trends in Cancer Management / F. R. Khan, S. S. Alhewairini. — DOI: 10.5772/intechopen.81517. – Текст : электронный //Zebrafish (Danio rerio) as a Model Organism. —2018 – URL: https://www.intechopen.com/chapters/64178(дата обращения: 15.10.2022).

eLIBRARY.RU : научная электронная библиотека : сайт. –Москва, 2018 – Organism-level tumor models in zebrafish danio rerio – URL:https://www.elibrary.ru/item.asp?id=35640002(дата обращения: 15.10.2022). – Режим доступа: для зарегистрир. пользователей. – Текст : электронный.

zfin.org : The Zebrafish Information Network : сайт. – Monroe – . – URL: https://zfin.org(дата обращения: 24.10.2022). – Режим доступа: свободный. – Текст : электронный.

Lebedeva,L. Zebrafish ( Danio rerio) as a Model for Understanding the Process of Caudal Fin Regeneration / L. Lebedeva, B. Zhumabayeva, T. Gebauer, I. Kisselev, Z. Aitasheva. – Текст : электронный //National Library of Medicine PubMed.gov. – URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33259770(дата обращения: 15.10.2022).

Marques, I. J. Model systems for regeneration: zebrafish / I. J. Marques, E. Lupi, N. Mercader.– Текст : электронный //National Library of Medicine PubMed.gov. – URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31540899 (дата обращения: 17.10.2022).

Wan, J. Retina regeneration in zebrafish / J. Wan, D. Goldman.– Текст : электронный //National Library of Medicine PubMed. gov. – URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27281280 (дата обращения: 17.10.2022).

Tahara, N. Cell migration during heart regeneration in zebrafish /N. Tahara, M. Brush, Y. Kawakami.– Текст : электронный //National Library of Medicine PubMed.gov. – URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27085002 (дата обращения: 18.10.2022).

Wen-Yee Choi. Cardiac regeneration /Wen-Yee Choi, Kenneth D Poss.– Текст : электронный //National Library of Medicine PubMed.gov. – URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22449849 (дата обращения: 21.10.2022).

Prabesh Bhattarai . Neuron-glia interaction through Serotonin-BDNF-NGFR axis enables regenerative neurogenesis in Alzheimer's model of adult zebrafish brain / P.Bhattarai, M. I. Cosacak, V. Mashkaryan .– Текст : электронный //National Library of Medicine PubMed.gov. – URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31905199 (дата обращения: 21.10.2022).

Просмотров работы: 355