XV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2023

Кишечная палочка (лат. Escherichia coli) — вид грамотрицательных факультативно-анаэробных подвижных палочковидных бактерий. E. coli является обитателем нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека.

 

Вид кишечная палочка (лат. E. coli) включён в род эшерихии (лат. Escherichia), семейство энтеробактерии (лат. Enterobacteriaceae), порядок энтеробактерии (лат. Enterobacteriales), класс гамма-протеобактерии (лат. γ-proteobacteria), тип протеобактерии (лат. Proteobacteria), царство бактерии. [8]

Изучение E. coli также сыграло важную роль в развитии современной промышленной микробиологии и биоинженерии. Работа Стенли Нормана Коэна и Герберта Бойера на E. coli, с использованием плазмид и эндонуклеаз рестрикции для создания рекомбинантной ДНК, стала одной из фундаментальных для современной биотехнологии. Впервые технология рекомбинантных ДНК была успешно применена с целью синтеза аналога инсулина человека колонией кишечной палочки. [2]

Большой интерес к E. coli как к модельному объекту возник в конце XX столетия и поддерживается в настоящее время по причине незаменимости данного вида бактерий в широком спектре исследований. На сегодняшний день E. coli является одним из наиболее часто использующихся биообъектов научных и клинических исследований. Модифицированные штаммы E. coli используются при разработке вакцин, синтеза биологически активных веществ, и решения других задач. [2]
Кишечные палочки устойчивы во внешней среде, длительное время сохраняются в почве, воде, фекалиях. Хорошо переносят высушивание. Кишечные палочки обладают способностью к размножению в пищевых продуктах, особенно в молоке. Быстро погибают при кипячении и воздействии дезинфицирующих средств (хлорной извести, формалина, фенола, сулемы, едкого натра и др.). Кишечные палочки более устойчивы во внешней среде по сравнению с другими энтеробактериями. Прямой солнечный свет убивает их в течение нескольких минут, температура 60°С и 1 % раствор карболовой кислоты — в течение 15 минут. [4]
Рис. 1.

E. coli — грамотрицательная бактерия, факультативный анаэроб, не образует эндоспор. Клетки палочковидные, со слегка закруглёнными концами, размером 0,4—0,8 × 1—3 мкм, объём клетки составляет около 0,6—0,7 мкм³. Кишечная палочка может жить на разных субстратах. В анаэробных условиях E. coli образует в качестве продукта жизнедеятельности лактат, сукцинат, этанол, ацетат и углекислый газ. Часто при этом образуется молекулярный водород, который мешает образованию указанных выше метаболитов, поэтому E. coli часто сосуществует с микроорганизмами, потребляющими водород — например, с метаногенами или бактериями, восстанавливающими сульфат.
Оптимальный рост достигается культурами E. coli при температуре 37°C, некоторые штаммы могут делиться при температурах до 49°C. Рост может стимулироваться аэробным или анаэробным дыханием, различными парами окислителей и восстановителей, в том числе, окислением пирувата, формиата, водорода, аминокислот, а также восстановлением кислорода, нитрата, диметилсульфоксида и триметиламин N-оксида. [8]

E. coli — модельный организм без недостатков. Тем не менее в сфере биотехнологий, принято считать, что у этой бактерии от природы нет системы бактериального иммунитета CRISPR/Cas. Именно поэтому эту систему, ныне незаменимую в генной инженерии, открыли относительно поздно. [6]

E. coli играет важную роль в современной промышленной микробиологии и биологической инженерии. Работа Стенли Нормана Коэна и Герберта Бойера на E. coli с использованием плазмид и эндонуклеаз рестрикции для создания рекомбинантной ДНК находится у истоков современной биотехнологии.

Кишечную палочку считают универсальным организмом для синтеза чужеродных белков. В E. coli исследователи вводят гены при помощи плазмид, что позволяет осуществлять биосинтез белков для промышленной ферментации. Также разработаны системы для синтеза в E. coli рекомбинантных белков. Одним из первых примеров использования технологии рекомбинантных ДНК является синтез аналога инсулина человека. Модифицированные E. coli используют при разработке вакцин, синтеза иммобилизованных ферментов и решения других задач. Однако в организме E. coli невозможно получать некоторые крупные белковые комплексы, содержащие дисульфидные связи, в частности, белки, для проявления биологической активности которых требуется посттрансляционная модификация. [5]

Гены из генома кишечной палочки также используются для генетической модификации растений, в частности из нее выделяют ген устойчивости к антибиотикам неомицину и канамицину. [8]

E. coli часто используют в качестве модельного организма в микробиологических исследованиях. Культивируемые штаммы, например, E. coli K12 хорошо приспособлены к росту в лабораторных условиях, и, в отличие от штаммов дикого типа, неспособны заселять кишечник. Многие лабораторные штаммы утеряли способность образовывать биологические плёнки. Описанные особенности предохраняют штаммы дикого типа от антител и химических агентов, но требуют больших затрат вещества и энергии. [8]

В 1946 году Джошуа Ледерберг и Эдуард Тейтем описали явление конъюгации бактерий, используя кишечную палочку в качестве модельного организма. E. coli остаётся одной из наиболее востребованных бактерий при изучении конъюгации и в настоящее время. E. coli была важным компонентом первых экспериментов по генетике бактериофагов, ранние исследователи, например, Сеймор Бензер, использовали E. coli и фаг T4 для изучения структуры генов. До исследований Бензера не было известно, имеет ген линейную или разветвлённую структуру. [8]

Кишечная палочка E. coli была одним из первых организмов, чей геном был полностью секвенирован. Последовательность нуклеотидов в геноме штамма К12 E. coli была опубликована в журнале Science в 1997 году. [8]

Долговременный эксперимент по эволюции E. coli был начат Ричардом Ленски в 1988 году и позволил непосредственно наблюдать эволюционные изменения в лабораторных условиях. В данном эксперименте одна популяция E. coli получила возможность аэробно метаболизировать цитрат. Такая способность встречается у E. coli в норме крайне редко. Неспособность к росту в аэробных условиях используют для того, чтобы отличить E. coli от других родственных бактерий, например, Salmonella. В ходе данного эксперимента в лабораторных условиях удалось наблюдать процесс видообразования. [8]

Вирулентные штаммы E. coli в норме отсутствуют в кишечнике, и заболевание наступает при заражении алиментарным путём. Передача патогенных E. coli часто происходит фекально-оральным путём. Частые пути передачи могут быть вызваны: низкой гигиеной приготовления пищи, загрязнением продуктов навозом, поливом урожая загрязнённой водой или сточными водами, при выпасе диких свиней на пашнях, употреблением для питья воды, загрязнённой сточными водами. [8]

Вирулентные штаммы E. coli могут вызывать гастроэнтериты, воспаления мочеполовой системы, а также менингит у новорождённых. В редких случаях вирулентные штаммы также вызывают гемолитический-уремический синдром, перитонит, мастит, сепсис и грамотрицательную пневмонию. [8]

Долговременный эксперимент по эволюции E. coli — уникальный эксперимент по эволюции бактерии Escherichia coli в искусственных условиях, проводимый группой под руководством Ричарда Ленски в университете штата Мичиган. В процессе эксперимента прослежены генетические изменения, происходившие в 12 популяциях E. coli на протяжении более чем 60000 поколений. Эксперимент начался 24 февраля 1988 года и продолжается более 30 лет. [2]

За время эксперимента обнаружен широкий спектр генетических изменений. Наиболее значительными адаптациями стали появившаяся у одной из популяций способность усваивать цитрат натрия, а также возникновение полиморфных сообществ путём разделения колонии на отдельные сосуществующие и самостоятельно эволюционирующие популяции. [2]
Целью эксперимента был поиск ответа на некоторые важные вопросы эволюционной биологии:

Каким образом меняется во времени скорость эволюционных изменений;

Какова повторяемость эволюционных изменений для различных популяций, существующих в одинаковой среде;

Каково соотношение эволюции на генотипическом и фенотипическом уровнях. [2]

Выбор бактерии E. coli объясняется быстрой сменой поколений у этого организма и небольшим размером генома, что позволяет за короткий период времени исследовать процессы, которые у более сложных организмов занимают тысячелетия. Благодаря тому, что эта бактерия десятилетиями используется в молекулярной биологии, она хорошо исследована, технологии работы с ней хорошо отлажены. Бактерия без потери жизнеспособности может длительно сохраняться в замороженном состоянии, что позволяет вести своеобразную «летопись эксперимента», а размораживание нужного поколения позволит при необходимости повторить эксперимент с любой ранее сохранённой точки. [3]

В качестве предкового штамма E. coli был взят «штамм Bc251», описанный в 1966 году Сеймуром Ледербергом  и использованный Брюсом Левиным в экспериментах по бактериологической экологии в 1972 году. Характерными чертами этого штамма были T6^r (устойчивость к бактериофагу T6), Str^r (устойчивость к стрептомицину), r⁻m⁻ (рестрикционная и модификационная активности выключены), Ara⁻ (неспособность усваивать арабинозу). Перед началом эксперимента путём точечной мутации оперона ara Ленски подготовил вариант Ara⁺ этого штамма, способный усваивать арабинозу. [3]

В начале эксперимента были созданы 12 популяций исходного штамма (6 популяций Ara⁺ и 6 Ara⁻, получившие обозначение A+1 … A+6 и A−1 … A−6 соответственно). Для точной идентификации каждой популяции были задействованы генетические маркеры. Каждая популяция размножалась в искусственной среде, где скорость размножения ограничивалась стрессовыми условиями (недостатком основного продукта питания — глюкозы). Каждый день 0,1 мл содержимого каждой пробирки переносилось в пробирку с 10 мл свежей питательной среды, где размножение бактерий продолжалось. Каждое 500-е поколение (что соответствует интервалу в 75 дней) замораживалось в глицерине при температуре −80 °C, чтобы в будущем с появлением новых методов анализа имелась возможность провести более подробное исследование. По ходу эксперимента полностью секвенировался геном предкового штамма, а также геномы некоторых этапных поколений (поколения 2000, 5000, 10 000, 15 000, 20 000 и 40 000). [2]

Поскольку размер генома E. coli составляет 4,6 млн нуклеотидных пар, то при наблюдаемой скорости мутаций (около 1000 замен нуклеотидных пар в день), каждая пара нуклеотидов в геноме за 20 лет заменяется в среднем более одного раза. Не все мутации, возникающие в геноме, равнозначны. Полезность мутации определяется скоростью размножения их носителей. Повышенная скорость размножения позволяет мутировавшей бактерии вытеснять из популяции бактерии с отсутствующей мутацией. При этом мутация «фиксируется» и присутствует в геноме всех последующих поколений. Вредные мутации действуют противоположным образом. Существуют также «нейтральные» мутации, которые не влияют на скорость размножения бактерий, так как возникают в незначимых участках генома. Эти мутации не фиксируются и не подавляются отбором и, таким образом, появляются и исчезают случайным образом. [3]

В эксперименте использовалась линия E. coli, размножающаяся исключительно делением (без полового процесса). Таким образом, круг исследуемых явлений ограничивался вновь возникшими мутациями. [3]

В работе приводятся результаты исследования популяции A-1, одной из 12, участвовавших в эксперименте. Авторы разделяют эволюцию популяции на два этапа, граница между которыми примерно приходится на поколение 26 000. [3]

При секвенировании генома поколения 20 000 и сравнении его с геномом исходного штамма были обнаружены 45 фиксированных мутаций разного типа (замена нуклеотидов, вставки, замены, инверсии, встраивание мобильных элементов), из которых основная масса (29) пришлась на однонуклеотидные замены. Скорость накопления фиксированных мутаций в течение первого этапа эксперимента оставалась примерно постоянной. Неожиданным оказалось то, что приспособленность бактерий к среде, выражавшаяся в скорости размножения, до поколения 1500 росла очень быстро, затем её рост замедлился при прежней скорости фиксирования мутаций. [3]

В других популяциях за первые 20 000 поколений менее 100 фиксированных мутаций, из которых полезными были только от 10 до 20. [3]

Картина эволюционных изменений в популяции А-1 кардинально изменилась после поколения 26 000. В этот момент произошла мутация в гене mutT, который кодирует белок, участвующий в репарации ДНК. В результате этого среднее число фиксированных мутаций резко возросло до 0,05 за поколение (по сравнению с 0,002 на первом этапе). Всего в поколениях 20 000—40 000 зафиксировалось 609 мутаций. Аналогичное увеличение скорости мутагенеза наблюдалось в трёх других популяциях из 12. [3]

К 2017 году, когда эксперимент продолжался уже 29 лет, неожиданно обнаружилось, что в 9 популяциях из 12 произошла экологическая диверсификация. Исходная монокультура разделилась на отдельные популяции, которые продолжали эволюционировать отдельно, не вытесняя друг друга. [3]

Первоначальной задачей эксперимента являлось наблюдение за эволюцией бактериального сообщества в предельно простых обстоятельствах — в постоянной среде, при наличии единственного источника пищи, без генетического обмена и экологического взаимодействия между организмами. Однако со временем произошло спонтанное усложнение популяции с появлением раздельных экологических ниш. Простейший пример такого рода разделения — образование двух микробных сообществ, каждое из которых имеет свой тип обмена веществ, где используются продукты жизнедеятельности другого сообщества. Впервые этот эффект замечен в 2014 году на одной из популяций (Ara-2), а к 2017 году обнаружен в 9 популяциях из 12. При этом продолжается обычная адаптивная эволюция, наблюдавшаяся во всех популяциях с самого начала эксперимента, однако теперь эта эволюция происходит не в масштабах популяции в целом, а в каждом из бактериальных сообществ. В этих условиях скорость размножения бактерий как показатель степени приспособленности частично теряет смысл, так как приспособленность теперь зависит от эффективности взаимодействия с другими сообществами. [3]

Было замечено, что на ранних и поздних этапах адаптации наиболее интенсивная фиксация мутаций происходила в разных генах.Этот феномен объясняется тремя факторами:

Быстрее фиксируются мутации, сразу дающие заметный прирост приспособленности организма.

Уже зафиксированные мутации меняют степень полезности других мутаций. Некоторые мутации становятся полезными только если предварительно сформировался определённый генетический контекст.

С появлением в популяции отдельных бактериальных сообществ бактерии начинают приспосабливаться не к простой и стабильной среде, а к динамичному экологическому окружению. [2]

Таким образом, эксперимент разрушил прежние представления об адаптации бесполой популяции к стабильным условиям среды. Вопреки ожиданиям, замедления адаптивной эволюции практически не происходит, а по достижении определённой степени приспособленности популяции к среде возникает спонтанное усложнение структуры популяции. [3]

Список литературы

1. Методы биологических исследований // dereksiz URL: https://dereksiz.org/metodi-biologicheskih-issledovanij.html (дата обращения: 08.11.2022).

2. Долговременный эксперимент по эволюции E. coli // academic URL: https://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/1484945 (дата обращения: 08.11.2022).

3. Alexname // handcent URL: https://handcent.ru/stati/11055-dolgovremennyy-eksperiment-po-evolyucii-e-coli.html (дата обращения: 07.11.2022).

4. Кишечная палочка в биотехнологии // 8 medics URL: https://8mo.ru/kishechnaja-palochka-v-biotehnologii/ (дата обращения: 05.11.2022).

5. Кишечная палочка объект биотехнологии // bars-med URL: https://bars-med.ru/kishechnaja-palochka-obekt-biotehnologii/ (дата обращения: 08.11.2022).

6. Применение кишечной палочки в биотехнологии // bars-med URL: https://bars-med.ru/primenenie-kishechnoj-palochki-v-biotehnologii/ (дата обращения: 08.11.2022).

7. Кишечная палочка — Escherichia coli (эшерихия коли). Две стороны одной медали // Кишечная палочка URL: https://normoflorin.ru/kishechnaya-palochka/ (дата обращения: 09.11.2022).

Код для цитирования: Скопировать