XIV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2022

Актуальность. Первичная культура – культура клеток, полученная непосредственно из тканей опухоли пациента до первого пересева. Она обладает характеристиками, более близкими к условиям exvivo, поскольку содержит не только опухолевые клетки, но и включает элементы микроокружения: стромальные компоненты, клетки иммунной системы [1]. Однако, в отличие от иммортализованной клеточной линии, такая культура может проявлять гетерогенность при субкультивировании и изменять морфологию клеточного состава [2-4].

В нашем исследовании мы получили семь первичных культур клеток от пациенток с Luminal А подтипом карциномы молочной железы, и сравнили морфологическую характеристику культур клеток от нулевого пассажа до четвертого, а также определили природу клеток, поскольку эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) является одним из важных признаков агрессивности опухолевого процесса [5]. Имеются данные о морфологии клеток в случае ЭМП, в которых отмечены свойства эпителиальных клеток: полигональная форма, способность создавать плотные контакты между клетками и свойства мезенхимальных клеток: веретенообразная форма и слабые контакты, что обуславливает их способность к миграции и инвазии [6].

Материалы и методы. Материал для исследования был получен от 7 пациенток с определенным Luminal-А иммуногистохимическим подтипом, не получавших адьювантной терапии. Образцы опухоли измельчали, помещали в смесь ферментов коллагеназа-гиалуронидаза. После диссоциации раствор центрифугировали при 0,7 RPM в течение 30 секунд, супернатант сливали. Полученный осадок ресуспендировали ферментами: трипсином и смесью диспаза-ДНКаза. После растворения в каждом ферменте смесь разбавляли HF (раствор Хэнкса с 10% FBS)1:1 и центрифугировали при 1,4 RPM (5 мин). Супернатант сливали, осадок помещали в питательную среду Mammocult в 5мл флаконы. После образования монослоя дезагрегация клеток осуществлялась с помощью трипсина, при этом часть клеток вновь помещали во флаконы со свежей питательной средой, часть - пересаживали на предметные стекла для анализа. В каждом случае культуру оценивали до 4 пассажа.

Для оценки морфологии клеток производили окрашивание по Паппенгейму. Иммуноцитхимические исследования проводились в автостейнере Dako Link. Для определения фенотипа опухоли использовали антитела anti-Pan Keratin (AE1/AE3/PCK26) Primary Antibody (Roche diagnostics, USA). Уровень панцитокератина определялся как процентное соотношение окрашенных клеток к общему количеству в 5 полях зрения.

Результаты.

При исследовании первичной культуры (нулевой пассаж, Р₀) большую часть (90%) составляли мелкие (4-6 мкм) и средние (10-12 мкм) округлые клетки, с чёткими границами. Ядро с ровными контурами, плотное, гиперхромное, окружено узким ободком гомогенной цитоплазмы. Вторая группа клеток (10%) - полигональные крупные (16-18 мкм) клетки, чаще треугольной формы, с чёткими неровными границами, образованными многочисленными мелкими выпячивания плазмолеммы. Ядро расположено центрально, светлоокрашено, с равномерным рисунком хроматина. Ядрышки не определяются. Эндоцитоплазма более плотная, мелкозернистая (предположительно органеллы), эктоцитоплазма светлая, пенистая.

На первом пассаже (Р₁) в культурах определяется 60% мелких и средних (вышеописанных) клеток. В пяти из семи анализируемых культурах появляются средние и крупные клетки овальной и полигональной формы (30%), с неровными границами. Ядро этих клеток округлое, с ровными контурами, светлое, расположено эксцентрично, мелкодисперсный хроматин
распределён равномерно, определяются 1-2 ядрышка. Цитоплазмы много, эндоцитоплазма более плотная, зернистая - содержит включения (органеллы), эктоцитоплазма светлая, пенистая, содержит большое количество мелкодисперсных вакуолей. Клетки лежат отдельно, без тенденции к слиянию.

Кроме того, 9,8% культуры составляют клетки веерообразной формы – вытянутые, один отросток тонкий длинный, на противоположном конце клетки широкий короткий веерообразный отросток. Ядро расположено в центре, ближе к веерообразному выросту, овальное, окрашено не плотно, рисунок хроматина равномерный, определяется ядрышко. Эндоцитоплазма плотная,
тёмноокрашена, содержит гранулы, эктоцитоплазма (в веерообразном выпячивании) светлая, пенистая, с большим количеством крупных вакуолей. Клетки лежат отдельно и группами по 4-7 клеток, в которых контактируют отростками.

В культурах этого пассажа (Р₁) так же появляются единичные гигантские клетки округлой формы с неровными границами.
Цитоплазмы много, светлоокрашена, эндоцитоплазма более плотная, зернистая, эктоцитоплазма светлая, содержит небольшое количество мелких
вакуолей. Ядро округлое, с ровными контурами, расположено в центре, светлое, рисунок
мелкодисперсного хроматина равномерный, определяется 1 крупное ядрышко.

При исследовании культур второго пассажа (Р₂) отмечено, что среди округлых и овальных клеток с ровными чёткими границами и крупным плотным гетерохроматиновым ядром, составляющих 62% клеток культуры, определяются клетки, имеющие фибробластоподобную (16%), веретеновидную (13%) и макрофагоподобную (9%) форму. Фибробластоподобные клетки (10-18мкм) имеют не чёткие границы, один тонкий, длинный отросток и толстые широкие выпячивания на противоположном полюсе клетки и латерально, заполненные светлой пенистой эктоцитоплазмой. Эндоцитоплазма плотная, содержит гранулы. Ядро овальное, светлое, расположено центрально, рисунок мелкодисперсного хроматина равномерный, определяется ядрышко. Клетки расположены группами по 5 и более клеток, плотно контактируют отростками.

Веретеновидные клетки (12-15 мкм) – вытянутые, с двумя тонкими отростками на противоположных полюсах клетки. Ядро расположено в центре, овальное, плотное, тёмноокрашено. Цитоплазмы незначительное количество, плотная. Клетки в культуре лежат как отдельно, так и группами, в которых контактируют отростками.

Также в культурах Р₂ отмечаются участки монослоя из клеток полигональной формы с чёткими границами, плотно прилежащих друг к другу. Ядра этих клеток светлые, определяются ядрышки, цитоплазма светлая, пенистая. На периферии группы клеток формируют выросты плазмолеммы.

На третьем пассаже (Р₃) в культурах можно выделить три группы клеток: мелкие (4-6 мкм) - 26%, средние (веретновидные и фибробластоподобные) – 69%. Появляется 5% гигантских (25-30 мкм) клеток правильной формы, с чёткими ровными
границами. Ядро занимает не более 1/3 объёма цитоплазмы, расположено эксцентрично - у одного из полюсов клетки. Форма ядра чаще неправильная (бобовидная, двулопастная). Глыбки мелкодисперсного хроматина расположены рыхло, ядрышко определяется редко. Цитоплазма светлоокрашена, эндоцитоплазма более плотная, содержит небольшое количество гранул, эктоцитоплазма - более гомогенная.
В этих клетках встречаются фигуры митоза (метафаза, телофаза), так же встречаются двухъядерные клетки.

На четвертом пассаже (Р₄) доля мелких и средних округлых клеток снижается до 3%, тогда как большую часть клеток, до 82%, составляют фибробластоподобные клетки и увеличивается доля гигантских полигональных клеток (15%).

При оценке уровня панцитокератина в полученных культурах наибольший процент окрашенных клеток, сохраняющих эпителиальную природу, наблюдается на первом и втором пассаже. К четвертому пассажу доля эпителиальных клеток снижается с появлением в культурах клеток, демонстрирующих мезенхимальный фенотип.

Выводы.

Таким образом, оценка роста культур и морфологическое исследование клеточных популяций в культуре LuminalAподтипа показали, что клеточные культуры, полученные от разных образцов опухолей, однонаправленно проявляют гетерогенность и полиморфизм популяций культивируемых клеток, при этом в процессе субкультивирования теряется способность клеток сохранять эпителиальный фенотип, что необходимо учитывать при отработке методики создания персонифицированных культур.

Список литературы

1. Могиленских А.С., Сазонов С.В.Cоздание клеточных линий карциномы молочной железы. //Гены и Клетки. 2021. Т. 16. № 1. С. 15-23.

2. Геращенко Т.С., Денисов Е.В., Литвяков Н.В., и др. Внутриопухолевая гетерогенность: природа и биологическое значение (обзор). //Биохимия. 2013. 78. С. 1531-1549.

3. Галимова Э.С., Галагудза М.М. Двухмерные и трёхмерные модели культур клеток опухолей in vitro. Преимущества и недостатки. //Бюллютень сибирской медицины. 2018. 17 (3). С.188-196.

4. Могиленских А.С., Шамшурина Е.О. Морфологическая оценка клеток карциномы молочной железы тройного негативного подтипа в культуре. //Гены и Клетки. 2020. Т. 15. № S3. С. 104.

5. Богуши Т.А., Калюжный С.А., Четыркина М.Р., Ястребова М.А., Щербаков А.М., Мамичев И.А., Каменский А.А. Экспрессия виментина в культурах клеток эпителиальных опухолей человека.//Успехи молекулярной онкологии. 2018. №2. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/ekspressiya-vimentina-v-kulturah-kletok-epitelialnyh-opuholey-cheloveka (дата обращения: 14.02.2022).

6. Ye X., Weinberg R.A.. Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression. Trends Cell Biol. 2015. vol. 25 no. 11. P. 675-686.

Код для цитирования: Скопировать