XIV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2022

Ключевую роль в борьбе с вирусами, в организме человека, играют интерфероны. Интерфероны (IFN) – это группа белков, которые выделяются клетками в ответ на вирусную инфекцию. В определенных вариантах интерфероны начинают выделяться в ответ на заражение некоторыми видами бактерий. В 1957 году ученые Алик Айзекс и Жан Линдеман наблюдали, что мыши, болеющие одним вирусом, не заражались другими вирусами. Экспертам несложно было прийти к заключению о том, что в ответ на вирусную инфекцию клетки вырабатывают определенные вещества, обладающие противовирусной активностью.

В настоящее время известно более 20 интерферонов, которые делятся на три типа:

Тип I – вирусные интерфероны. К ним относятся альфа (IFN-α) и бета (IFN-β) интерфероны и несколько других. Данные интерфероны вырабатываются в ответ на вирусы, а также компоненты бактерий, стимулирующие не только выработку интерферона, но и другие иммунные механизмы.

Тип II – иммунный интерферон, включающий гамма интерферон (IFN-γ). В отличие от интерферонов первого типа, которые первыми реагируют на вирусную инфекцию, гамма интерферон вырабатывается на последующих стадиях инфицирования.

Тип III – интерферон лямбда (IFN-λ). Этот тип интерферонов открыли недавно, и по механизму действия он напоминает первый тип интерферонов.

Усиленная выработка интерферонов наступает при заражении клетки. Это сигнальная молекула, которая влияет на соседние клетки и запускает в них процессы, препятствующие размножению вируса. Под действием интерферонов в клетках синтезируются специфические ферменты, мешающие сборке вирусных частиц. Так, вирус не может дальше размножаться и поражать наш организм[3].

Получают интерферон двумя способами:

1) путем инфи­цирования лейкоцитов или лимфоцитов кро­ви человека безопасным вирусом, в результате чего инфицированные клетки синтезируют интерферон, который затем выделяют и конс­труируют из него препараты интерферона;

2) генно-инженерным способом — выра­щивание в производственных условиях рекомбинантных штаммов бактерий, способных продуцировать интерферон. Чаще всего используют рекомбинантные штаммы псевдомонад, кишечной палочки со встроенными в их ДНК генами интерферона. Рекомбинантным называют интерферон, получен­ный генно-инженерным способом. В нашей стране рекомбинантный интерферон получил офици­альное название «Реаферон». Производство данного препарата во многом эффективнее и дешевле, чем лейкоцитарного[2].

Национальные референсные образцы человеческого лейкоцитарного ИФН были разработаны к 1969 г. в Национальном институте биологических стандартов и контроля (Великобритания), Национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (США) и Государственном научноисследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (СССР/Россия). В 1978 г. ВОЗ выпустила меморандум, обобщивший накопленный мировой опыт по производству, контролю качества и клиническому применению ИФН. В меморандуме было сформулировано требование о необходимости стандартизации препаратов ИФН[5].

Главным недостатком получения интерферонов из лейкоцитов человека является вероятность смешения конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатитов В и С, вируса иммунодефицита и др.

В настоящее время более перспективным способом получения интерферона является микробиологический синтез, который гарантирует возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья.

В качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона, является сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимо строго поддерживать концентрацию индуктора, конкретно метанола, в процессе биосинтеза.

Недостатком использования штаммов Ps. putida является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Наиболее продуктивным является использование штаммов Escherichia coli.

Однако не смотря на все недостатки данных методов, были созданы и используются для получения интерферона большое количество плазмид и созданных на их основе штаммов Е. coli, экспрессирующих интерферон: штаммы Е. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмидами Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), штамм Е. coli pINF- AP2 (SU 1312961), штамм Е. coli pINF- F-Pa (AU 1312962), штамм E.сoli SG 20050 с плазмидой p280/21FN [4], штамм E.сoli SG 20050 с плазмидой pINF14 (SU 1703691), штамм E.coli SG 20050 с плазмидой pINF16 (RU 2054041) и др. Недостатком технологий, основанных на использовании этих штаммов, является их нестабильность, а также недостаточный уровень экспрессии интерферона.

Перспективным вариантом для получения бета-интерферона человека в значительных количествах является использование микроорганизмов в качестве продуцентов этого препарата. Существует ряд штаммов Escherichia coli, продуцирующих бета-интерферон человека. Уровень продукции варьирует от 1.5 до 6000 млн. ед. биологически активного бета-интерферона на литр культуры и составляет в некоторых случаях несколько десятков миллиграммов. Его содержание в клетках может достигать около 2% суммарного клеточного белка.

Также известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование штамма E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульоне в колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 3М раствором мочевины в буфере, растворяют в растворе гуанидин хлорида в буфере, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют, проводят окислительный сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины, ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и сефадексе G-50. Недостатками этого способа является его невысокая производительность основных этапов процесса выделения и очистки. В частности, это относится к ультразвуковой обработке продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности выхода интерферона, а также к невозможности использования этого метода для промышленного производства интерферона.

По сравнению с используемой питательной средой, условиям культивирования, принципу конструирования плазмиды и достигаемому результату штамм E.coli SG20050/plF14 наиболее близок к штамму E.coli SG20050/plF16. Преимуществом штамма-продуцента E.coli SG20050/plF16 является высокий уровень биосинтеза интерферона, который достигает 3-5×107 ME/мл клеточной суспензии, что составляет более 50 % суммарного белка бактерий. Штамм разработан Всесоюзным научно-исследовательским институтом молекулярной биологии НПО "Вектор" (ГНЦ ВБ «Вектор») и является объектом защиты по патенту РФ N 2054041.

Кроме того, известен способ получения альфа-интерферона с использованием рекомбинантного штамма Escherichia coli 294/pLelFA (ATCC 31446) с плазмидой, содержащей структурный ген человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа A (патент США N 4656131). Биомассу E.coli 294 выращивают в 5-литровом ферментере на химически определенной среде. Используют стандартную среду М-9, обогащенную добавлением глюкозы, L-глутамата натрия, хлорида железа шестиводного, сульфата меди пятиводного, сульфата цинка, витамина B1, тетрациклина гидрохлорида, L-пролина и L-лейцина. Культивирование ведут при перемешивании 1000 об/мин, аэрации 1 л/л питательной среды в мин и при температуре 37 градусов по Цельсию, в ходе процесса температуру ступенчато понижают до 25 градусов в зависимости от оптической плотности культуральной жидкости. В течение культивирования добавляют глюкозу по мере ее потребления до исходного уровня 25 г/л, что обеспечивает уровень биосинтеза интерферона около 3,2×107 ед. активности на мл культуральной жидкости.

Недостатками описанного способа являются: технология получения интерферона-альфа человека микробиологическим синтезом осуществляется на лабораторном оборудовании; использование многокомпонентной дорогостоящей питательной среды, содержащей очищенные аминокислоты и витамин B1; прямой перенос результатов от лабораторной установки к промышленному аппарату сомнителен, так как методы теории подобия, позволяющие получать критерии масштабирования, в биотехнологии, так же как и в химической технологии, непригодны; для достижения высокого выхода целевого продукта используют дробное многократное добавление раствора глюкозы, что усложняет технологический процесс и пожалуй, главным недостатком является то, что используемый штамм недоступен российским производителям[4].

Всего к настоящему времени описано более 300 различных эффектов ИФН, которые и определяют медицинскую значимость препаратов этого типа. Основные биологические эффекты ИФН включают подавление роста внутриклеточных и внеклеточных инфекционных агентов вирусной и невирусной природы (хламидии, риккетсии, простейшие, бактерии); антипролиферативную активность; противоопухолевый эффект; антимутагенный эффект; антитоксическое действие; подавление или усиление продукции антител; стимуляцию макрофагов, усиление фагоцитоза; активацию естественных киллерных клеток; многочисленные изменения клеточных мембран; стимуляцию выработки факторов и молекул адгезии. Таким образом, интерфероны оперативно предупреждают самые первые негативные процессы взаимодействия носителей чужеродной информации (особенно вирусной) с организмом, благодаря чему они заняли достойное место среди современных средств терапии вирусных и онкологических заболеваний[1].

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

Иммунотерапия. 2-е издание, переработанное и дополненное, под редакцией Р.М. Хаитова, Р.И. Атауллаханова, А.Е. Шульженко, Москва «ГЭОТАР-Медиа» 2018, с. 125.

Интерфероны, природа. Способы получения и применения. [Электронный ресурс].-Режим доступа: https://studfile.net/preview/6159969/page:8/

Собственный интерферон – лучший из возможных [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://irs19.ru/knowledge/immunitet/interferony/

Технология получения интерферона [Электронный ресурс].-Режим доступа: https://www.myunivercity.ru/

Interferon and other antiviral agents, with special reference to influenza: a Memorandum // Bull. World Health Organ. 1978. Vol. 56, N 2. P. 229–240.

Код для цитирования: Скопировать