XIV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2022

Круговорот а.зота. в природе является одним из ключевых звеньев биогеохимических циклов Земли, а.тмосфера. которой почти на. 80% (по объему) состоит из этого химического элемента. и служит его основным источником.

А.зот входит в соста.в протеинов, а. та.кже других молекул, соста.вляющих основу структурной орга.низа.ции всех уровней живого. Человеку и животным он необходим в виде протеинов животного и ра.стительного происхождения, ра.стениям – в виде солей а.зотной кислоты и ионов а.ммония [1–3].

Микроорга.низмы, усва.ива.ющие молекулярный а.зот а.тмосферы, - диазотрофы, имеют сходный биохимический меха.низм фикса.ции а.зота.. Существуют две основные группы фиксирующих а.тмосферный а.зот микроорга.низмов: 1 - вступа.ющие в симбиоз с высшими ра.стениями (роды ба.ктерий Rhizobium, Bra.dyrhizobium, Mezorhizobium, Sinorhizobium, Azorhizobium) [4, 5] и 2 - свободноживущие. Ко второй группе относятся а.ссоциа.тивные а.зотфикса.торы (роды ба.ктерий Azospirillum, Pseudomonas, Agroba.cterium, Klebsiella, Ba.cillus, Enterobacter, Fla.voba.cterium Arthrobacter и др.) и микроорганизмы, более приспособленные к свободному существова.нию в почве (роды ба.ктерий Clostridium, Azotoba.cter, Beijerinckia и др.; а.зотфиксирующие фототрофные бактерии, цианоба.ктерии) [6]. Ра.зделение а.зотфикса.торов на. а.ссоциа.тивные и свободноживущие условно, поскольку способность к свободному обита.нию в почве ха.ра.ктерна. для всех а.зотфиксирующих ба.ктерий, при этом только симбиотические а.зотфикса.торы способны а.ссимилирова.ть молекулярный а.зот исключительно в тесном вза.имодействии с ра.стениями. Связи цианобактерий с другими орга.низма.ми доста.точно ра.знообра.зны [7]: они являются фикобионта.ми в лишайника.х, живут в воздушных ка.мера.х мхов, в листьях водных па.поротников и т. д. Следует отметить, что потенциа.льные возможности симбиотических а.зотфикса.торов значительно выше, чем свободноживущих.

Симбиотические и а.ссоциа.тивные системы ра.стений и диазотрофов могут служить примером эволюционно сложившегося специфического вза.имодействия живых орга.низмов, изучение которых приобрета.ет особую а.ктуа.льность в связи с внедрением высокопродуктивного и экологически чистого земледелия. Фикса.ция молекулярного а.зота. воздуха. биологическим путем — процесс связыва.ния и усва.ива.ния а.зота. микроорганизмами. Он имеет большое пра.ктическое зна.чение, поскольку промышленное производство химических а.зотных удобрений требует зна.чительных за.тра.т энергоресурсов, а. са.ми по себе они могут быть вредны с точки зрения экологии. Всестороннее изучение этой проблемы обусловлено та.кже необходимостью ра.зра.ботки новых эффективных биологических препа.ра.тов. Созда.ние и применение биопрепа.ра.тов на. основе а.зотфиксирующих микроорга.низмов — на.иболее эффективный прием повышения продуктивности ра.стений и ка.чества. их урожа.я, позволяющий сохра.нять естественное плодородие почв и экологическое ра.вновесие окружающей среды. Их использова.ние да.ет возможность регулирова.ть численность и а.ктивность полезной микрофлоры в ризосфере возделыва.емых культур, а. та.кже обеспечивать ра.стения а.зотом, фиксирова.нным из а.тмосферы. На.пример, в решении проблемы дефицита. полноценного протеина. ключева.я роль прина.длежит сое, одна.ко в почва.х, на. которых эта. культура. выра.щива.ется впервые [8], обычно отсутствуют специфические для нее клубеньковые ба.ктерии или же их количество незна.чительно (до 20 ед / г почвы).

Микроорга.низмы, соста.вляющие основу биопрепа.ра.тов, должны соответствова.ть ряду требова.ний, а. та.кже обла.да.ть определенными свойства.ми, в числе которых — вирулентность, а.ктивность и эффективность, специфичность, конкурентоспособность, технологичность (способность на.ка.плива.ть титр в ста.нда.ртной и производственной среде). Среди общих требова.ний к созда.нию биопрепа.ра.тов ва.жны следующие: высокий титр а.ктивных клеток, необходимый срок хранения, тра.нспорта.бельность, технологичность (ра.створимость, способность удержива.ться на. семена.х и т. д.), а. та.кже экономичность их производства.

Эффективность симбиотических систем «растение - микроорганизм» определяется вирулентностью и активностью микросимбионта. Вирулентность клубеньковых бактерий, в частности, - это способность проникать в корень бобового растения через корневые волоски и посредством сложных морфофизиологических изменений приводить к образованию клубеньков. Первая стадия проявления вирулентности – туморогенная активность, т. е. способность образовывать опухоли на корнях. Истинно вирулентным штаммам свойственна нодулирующая активность (клубенькообразование), заключающаяся в способности формировать полноценные клубеньки [9]. Клубенек – это сложно устроенный орган растения, основными структурами которого являются: инфицированная бактериями ткань, в которой происходит фиксация молекулярного азота; проводящая ткань, по которой поступают растительные фотосинтаты и выносятся продукты азотфиксации; меристема, за счет которой происходит рост клубенька [5, 10].

На определенных этапах формирования ассоциативного взаимодействия в ризоценозе или становления бобоворизобиального симбиоза проявляются другие важные свойства бактерий, такие как азотфиксирующая активность - скорость восстановления N₂ в NH₃ и симбиотическая эффективность - способность растений интенсивно развиваться, используя симбиотрофное питание азотом. Симбиотическая эффективность в значительной степени определяется азотфиксирующей активностью клубеньков, особенно в условиях дефицита связанного азота, однако зависит также и от ряда факторов, не связанных непосредственно с азотфиксацией. Важную роль в определении продуктивности растительно-бактериальных взаимодействий может играть совместимость метаболических систем партнеров (в частности, путей транспортировки азота и углерода), а также отсутствие активных защитных реакций у растений в ответ на присутствие или проникновение микроорганизмов. Находящиеся в ризосфере или клубеньках бактерии могут синтезировать вещества, стимулирующие (фитогормоны, витамины) или угнетающие (ризобиотоксины) развитие растения хозяина [6, 10]. Установлено, что эффективные и неэффективные штаммы азотфиксирующих бактерий отличаются по ряду биохимических показателей. Эффективные штаммы, вероятно, имеют более богатый метаболический фонд и у них активнее протекают окислительно-восстановительные процессы [1].

Специфичность – способность бактерий избирательно вступать во взаимодействие с определенным видом или группой растений – является одной из важных систематических характеристик клубеньковых бактерий и тесно связана с их активностью. Ризобии, например, разделяют на активные, малоактивные и неактивные. Следует отметить, что вирулентность и активность бактерий могут зависеть от особенностей штамма, вида и сортовой специфичности растений, почвенно-климатических условий и ряда других факторов [5, 9].

Различные расы азотфиксирующих бактерий конкурируют между собой. Более вирулентные штаммы активнее других колонизируют или инокулируют корневую систему специфичных для них растений. Исследователи по разному трактуют понятие конкурентоспособности бактерий. С одной стороны, это способность конкурировать со спонтанно инокулирующими растения штаммами, а с другой – противостоять местной сапрофитной микрофлоре и вытеснять местные штаммы.

Для практического применения микроорганизмов создают их различные препаративные формы, такие как жидкая культура, препараты на гельных субстратах (бактериальные экзополисахариды, силикагель, высокодисперсные материалы) и твердых носителях (вермикулит, лигнин, перлит, торф) [6]. Получение производственных штаммов азотфиксирующих бактерий и создание биопрепаратов на их основе – длительный научно-производственный процесс, в котором можно выделить следующие этапы.

1. Научно-исследовательская работа:

– реизоляция микроорганизма азотфиксатора из естественной среды обитания;

– введение в культуру и аналитическая селекция перспективных штаммов;

– получение новых высокоэффективных штаммов генно-инженерными методами;

– изучение физиолого-биохимических характеристик, симбиотических свойств, конкурентоспособности, эффективности и технологичности азотфиксирующих бактерий;

– проведение научно-исследовательских испытаний, депонирование и патентование штаммов;

– хранение чистой культуры микроорганизмов в условиях музея.

2. Подготовительный этап производства:

– приготовление питательных сред и добавок;

– восстановление физиологической активности азотфиксирующих бактерий после условий хранения (пересев, реактивация на качалке-шейкере при постоянной температуре и аэрации);

– налаживание системы очистки воздуха и прочие мероприятия, предусмотренные особенностями конкретного производства (при необходимости).

3. Производственный процесс:

– культивирование бактерий на производственных качалках (шейкерах) в колбах или в ферментерах (биореакторы в виде специально устроенных камер, в которых происходит процесс выращивания микроорганизмов или ферментация;

– выделение конечного продукта (получение жидкой культуры микроорганизма);

– подготовка носителя (фасовка и стерилизация субстрата, внесение добавок) или тары для жидкой препаративной формы (стерилизация емкостей);

– инокуляция используемого носителя.

4. Хранение или инкубирование биопрепарата при определенном температурном режиме.

5. Контроль качества продукции (титр бактериальных клеток / 1 г препаративной формы, наличие посторонней микрофлоры).

6. Очистка сточных вод и газовых выбросов, утилизация отходов.

Список литературы

1.Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции / Под ред. Тихоновича И. А., Проворова Н. А. — СПб.: Наука, 2008. — 194 с.

2. Коць С. Я., Моргун В. В., Патыка В. Ф. и др. Биологическая фиксация азота: бобоворизобиальный симбиоз. — К.: Логос, 2011. —Т. II. — 523 с.

3. Новикова Н. И. Современные представления о филогении и систематике клубеньковых бактерий // Микробиология. — 2006. —Т. 65, № 4. — С. 437–450.

4. Панкратова Е. М., Зяблых Р. Ю., Калинин А. А. и др. Конструирование микробных культур на основе синезеленой водоросли Nostoc paludosum Kutz // Там же. —2004. — Т. 14, № 4. — С. 445–458.

5. Панкратова Е. М., Трефилова Л. В., Зяблых Р. Ю., Устюжанин И. А. Цианобактерия Nostoc paludosum Kutz как основа для создания агрономически полезных микробных ассоциаций на примере бактерий рода Rhizobium // Микробиология. —2008. — Т. 77, №2. — С. 266–272.

6. Сытников Д. М. Актуальность проблемы биологической фиксации азота атмосферы // Современные взгляды на эволюцию органического мира: программа и тезисы докладов междунар.науч. конференции, Украина, Киев, 18–20 ноября 2009 г. — К., 2009. — С. 77.

7. Трефилова Л. В. Использование цианобактерий в агробиотехнологии: Автореф. дисс.… канд. биол. наук: спец. 03.00.07 «Микробиология», 03.00.23 «Биотехнология». — Саратов, 2008. — 26 с.

8. Хотянович А. В. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применения препаратов на их основе (метод. рекомендации). — Л.: Б.и., 2011. — 60 с.

9. Шарыпова Л. А., Симаров Б. В. Способ сравнения конкурентоспособности эффективных штаммов Rhizobium meliliti // Тр. ВНИИ с.х. микробиологии. — 2005. — С. 85–91.

10. Пацко Е. В., Воробей Н. А., Паршикова Т. В., Коць С. Я. Перспективность использования ассоциаций азотфиксирующих микроорганизмов для повышения урожайности растений // Бюл. Моск. общ. исп. прир. —2009. — Т. 114, Вып. 2.— С. 84–86.

Код для цитирования: Скопировать