XIII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2021

Долговременные изменения синаптической пластичности, которая лежит в основе обучения и памяти, являются предметом внимания исследователей в течение ряда лет. Известно, что биологические процессы в нейронных системах, протекающие с участием белка DISC1, играют важную роль в развитии нервной системы и регуляции синапсов [1]. Показано, что нарушения в гене DISC1 связаны с дисфункциями мозга, характерными для ряда психических заболеваний (шизофрения, депрессия, биполярное расстройство и др.) [2].

Целью данной работы было изучение изменений синаптической пластичности у мутантных мышей линии Disc1-Q31L на примере длительной посттетанической потенциации на срезах гиппокампа.

Методы

В работе использовали мышей DISC1-Q31L в возрасте 2,5 мес., которых содержали при световом режиме 12/12 часов день/ночь, температуре 20-22^о С и свободном доступе к воде и пище. Все процедуры проводили в соответствии с Европейскими правилами обращения с лабораторными животными (Directive 2010/63/EU от 22 сентября 2010 года) и протоколом эксперимента, утвержденным Комитетом по биомедицинской этике ФИЦ ФТМ. Животные были получены в УНУ БК «Биологическая коллекция – Генетические биомодели нейропсихиатрических расстройств» НИИФФМ.

Электрофизиологические эксперименты проводили, как описано ранее [3] за исключением необходимых изменений в протоколе. Коротко, мозг животного быстро извлекался, на 1 минуту помещался в максимально охлажденный (не выше 4^oC) предварительно газированный карбогеном (газовая смесь 95% O₂ и 5% CO₂) раствор для приготовления срезов, затем срезы изготавливались при помощи виброслайсера NVSL (World Precision Instruments, США). Состав раствора в mM: 124 NaCl, 4.4 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1.3 MgSO₄, 26 NaHCO₃, 10 D-glucose, pH 7,4. Поперечные срезы гиппокампа толщиной 400 мкм после часового адаптационного периода в аэрируемой карбогеном среде (в мМ: 124 NaCl, 4.4 KCl, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄, 2.5 CaCl₂, 1.3 MgSO₄, 10 D-глюкоза, pH 7.4) переносили в экспериментальную камеру со средой того же состава. Все эксперименты в дальнейшем проводили при комнатной температуре (20–22^oC).

Внеклеточную регистрацию возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП) в системе синаптических связей «коллатерали Шаффера – пирамидные нейроны области СА1» вели при помощи стеклянных микроэлектродов, изготовленных из боросиликатного стекла диаметром 1,5 мм, заполненных той же средой и имевших сопротивление 3 – 6 МОм, размещенных в области stratum radiatum СА1. Стимуляцию проводили биполярным концентрическим металлическим электродом, размещенным в области коллатералей Шаффера. Стимулы в виде прямоугольных импульсов постоянного тока длительностью 100 мкс и амплитудой 50 – 250 мкА) наносились при помощи стимулятора A310 Accupulser (World Precision Instruments, США) и изолирующего устройства A 360 (WPI). Для выбора интенсивности стимуляции использовали метод парной фасилитации (Paired-pulse facilitation, два стимула одинаковой амплитуды и длительности наносятся с интервалом 50 мс) и для тетанизации применяли амплитуду стимула, при которой поп-спайк появлялся в ответе только на второй стимул (Рис.1). Как правило, выбранная таким образом амплитуда составляла около 50% от амплитуды стимула, вызывающего максимальный ответ.

В дальнейшем ВПСП регистрировали с интервалом 2 или 4 минуты. Высокочастотную стимуляцию (3 пачки импульсов длительностью 1 с, частотой 100 Гц, интервал между пачками 10 сек, проводится дважды с интервалом 10 мин) использовали для индукции длительной посттетанической потенциации (ДПТП, long-term potentiation, LTP). Электрический сигнал оцифровывали при помощи Digidata 1200 (Axon Instruments) с частотой 10 кГц и анализировали pCLAMP software (Axon Instruments, Molecular Devices, USA) и Microcal Origin 8.1 (OriginLab). Данные были представлены как M± SEM. Амплитуда ВПСП (fEPSP) была нормализована по отношению к 10-минутному контрольному периоду (базовая линия, baseline) перед тетанизацией. Ответы регистрировали в течение 1 часа после тетанизации и были представлены как амплитуда ВПСП, нормализованная по отношению к базовой линии.

Рисунок 1 - Запись сигнала в срезе гиппокампа мыши DISC1-Q31L при амплитуде стимула, выбранной для дальнейших экспериментов.

Регистрирующий электрод - в СА1 stratum radiatum, стимулирующий - в коллатерали Шаффера (парная фасилитация, межстимульный интервал 50 мсек).

Результаты и обсуждение

В наших экспериментах мы использовали линию мышей с точечной мутацией гена DISC1 DISC1-Q31L. Эта линия мышей была получена методом индуцированного этилнитрозомочевиной мутагенеза, который привел к точечной мутации во втором экзоне (A127T) гена DISC1, что вызвало замену глутамина на лейцин в аминокислоте 31 белка DISC1 (Q31L) [4]. Данные мутации были созданы при сотрудничестве лаборатории профессора Дж. Родера с исследователями биоресурсного центра RIKEN.

Линия зарегистрирована 31L/+ (Rgsc1393) и доступна в центре биоресурсов RIKEN и УНУ БК «Биологическая коллекция – Генетические биомодели нейропсихиатрических расстройств» НИИФФМ [5]. В качестве родительской линии были использованы мыши C57BL/6J. У мышей линии DISC1-Q31L выявлено нарушение синаптической пластичности гиппокампа, выражающееся в отсутствии поддержания длительной посттетанической потенциации (Рис. 2). Если у мышей DISC1-L100P обнаружено ранее [6] ослабление LTP, то у DISC1-Q31L через некоторое время после тетанизации наблюдается уменьшение потенциации до "базовых" значений, т.е. полное ее исчезновение.

Рисунок 2 - Выработка ДПТП в срезе гиппокампа мыши DISC1-Q31L.

Ось ординат: нормализованная амплитуда ВПСП, стрелкой указано время начала тетанизации.

В то же самое время нами не было обнаружено существенных различий в ответах при регистрации парной фасилитации на срезах гиппокампа мышей C57Bl/6j и мышей линии DISC1-Q31L (Рис. 1), т.е. различий в кратковременной синаптической пластичности не наблюдалось. Однако при часовой регистрации ДПТП обнаружено, что после высокочастотной стимуляции увеличенные в 1,5 раза амплитуды ВПСП сохраняются не более 40 минут и падают затем до исходных базовых значений, тогда как у мышей C57Bl/6j увеличенные в 1,5 раза амплитуды ВПСП сохраняются более 1 часа [3].

Известно, что DISC1 играет роль в раннем развитии и вовлечен в пролиферацию нейронов, миграцию клеток и рост нейритов [1,2]. Биологические процессы в нейронах, протекающие с участием белка DISC1 и его интерактома, могут играть важную роль в патологии шизофрении и депрессии [6,7]. Таким образом, обнаруженные нарушения синаптической пластичности у мышей DISC1-Q31L могут лежать в основе определенных патологий деятельности мозга.

Литература

1. Brandon NJ, Millar JK, Korth C, Sive H, Singh KK & Sawa A. Understanding the role of DISC1 in psychiatric disease and during normal development.// J Neurosci.- 2009.- 29.- 12768–12775.

2. Lipina T.V., Roder J.C. Disrupted-In-Schizophrenia-1 (DISC1) interactome and mental disorders: impact of mouse models.// Neurosci Biobehav Rev.- 2014.- 45: 271–94. DOI: 10.1016/j.neubiorev.2014.07.001

3. Lipina T.V., Beregovoy N.A., Tkachenko A.A., Petrova E.S., Starostina M.V., Zhou Q., Li S. Uncoupling DISC1*D2R protein-protein interactions facilitates latent inhibition in Disc1-L100P animal model of schizophrenia and enhances synaptic plasticity via D2 receptors // Front. Synaptic Neurosci. - 2018. - Vol. 10. ID 31. doi: 10.3389/fnsyn.2018.00031.

4. Clapcote S.J., Lipina T.V., Millar K.J. Mackie S., Christie S., Ogawa F., Lerch J.P., Trimble K., Uchiyama M., Sakuraba Y., Kaneda H., Shiroishi T., Houslay M.D., Henkelman R.M., Sled J.G., Gondo Y., Porteous D.J., Roder J.C. Behavioral phenotypes of Disc1 missense mutations in mice//Neuron.- 2007.- 54 (3): 387–402. - DOI:10.1016/j.neuron.2007.04.015.

5. Н.Д. Чижова, Т.В. Липина, Т.Г. Амстиславская. Характеристика поведения гетерозиготных мышей с мутациями L100P и Q31L в гене DISC1//Лабораторные животные для научных исследований.- 2019.- №3.- https://doi.org/10.29296/2618723X-2019-03-02.

6. Cui L, Sun W, Yu M, Li N, Guo L, Gu H, Zhou Y. Disrupted-in-schizophrenia1 (DISC1) L100P mutation alters synaptic transmission and plasticity in the hippocampus and causes recognition memory deficits// Mol Brain.- 2016.- Oct 12.- 9(1):89.

7. Tomoda ., Sumitomo A., Jaaro-Peled H., Sawa A. Utility and validity of DISC1 mouse models in biological psychiatry //Neuroscience. 2016 May 3;321:99-107. doi:10.1016/j.neuroscience.2015.12.061. Epub 2016 Jan 6.

Код для цитирования: Скопировать