XIII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2021

Все химические процессы, протекающие в живых организмах, контролируются ферментами, поэтому они играют важнейшую роль в жизнедеятельности всех живых существ на планете, а в особенности человека. Значительные достижения последних лет в области молекулярной биологии и генной инженерии во многом связаны с успешным использованием ферментов. С их помощью получают продукты питания, одежду, лекарственные препараты и сложные химические соединения. В медицине ферменты используют для лечения и диагностики различных заболеваний. Наука не стоит на месте и в настоящее время ферментам находят все большее применение в различных сферах деятельности человека, поэтому мы можем с полной уверенностью полагать, что выбранная нами тема сейчас является интересной и актуальной. 

Цель: исследование каталитической активности ферментов и их применения в промышленности и в быту.

Задачи:
1. Изучить историю открытия ферментов.
2. Раскрыть строение и механизм действия ферментов.

3. Охарактеризовать свойства ферментов и их классификацию.

4. Проанализировать применение ферментов в различных производствах и в быту.

5. Исследовать условия, влияющие на каталитическую активность ферментов на примере каталазы и амилазы слюны.

Объект исследования: ферменты.

Предмет исследования: условия проявления активности ферментов.
Методы исследования: анализ, синтез, обобщение, эксперимент.

История открытия ферментов

С деятельностью ферментов человечество знакомо очень хорошо с глубокой древности, хотя и не догадывалось об этом. Испокон веков люди знали способы приготовления хлеба, вина, пива, сыра, различных соусов, в которых основную роль играют процессы брожения, т. е. процессы, вызываемые микроорганизмами и выделяемыми ими ферментами. Промышленное производство ферментных препаратов началось около 100 лет назад. Изначально оно было основано на извлечении ферментов из сырья растительного и животного происхождения, а затем для этого начали активно применять микроорганизмы.

Термин фермент (от лат. fermentum – закваска) был предложен в начале ХVII в. голландским учёным Яном БаптистомВан-Гельмонтом для веществ, влияющих на спиртовое брожение.

Крупным событием второй половины XVIII в. стали исследования Л. Спалланцани по физиологии пищеварения, которые положили начало изучению ферментов пищеварительных соков.  Русский химик  К.С. Кирхгоф в 1814 г. описал ферментативный процесс осахаривания крахмала под влиянием вытяжки из проросших семян ячменя.

К середине XIX в. были найдены и другие ферменты: амилаза слюны, пепсин желудочного сока, трипсин сока поджелудочной железы. Й. Берцелиус ввёл в химию понятие о катализе и катализаторах, к числу последних были отнесены все известные в то время ферменты.

В 1878 г. Вилли Кюне ввёл термин энзим (от греч. ἔν – внутри, ζύμη – закваска) и предложил все белковые катализаторы разделить на две группы: ферменты и энзимы, причём вторым термином он предложил называть «закваску», действия которой распространяются вне живых организмов. И лишь 1897 год положил конец всем научным спорам: оба термины (энзим и фермент) решено использовать как абсолютные синонимы. Всё просто: слова «фермент» и «энзим» означают одно и то же – закваску: fermentum – на латыни, ζύμη или ἔνζυμον – по-гречески. 

Оба названия свидетельствуют о том, что первые сведения об этих веществах были получены при изучении процессов брожения.

Позднее Эдуард Бухнер добыл фермент из дрожжей и определил, что это вещество не является живым организмом. Вот как высказался Бухнер в своей Нобелевской лекции: «Мы всё более убеждаемся в том, что клетки растений и животных подобны химическим фабрикам, где в разных цехах производятся разные продукты. Энзимы в них выполняют роль контролёров. Наши знания об этих самых важных частях живых веществ постоянно увеличиваются. И хотя, возможно, нам ещё далеко до цели, мы шаг за шагом приближаемся к ней».

Роль ферментов в жизнедеятельности всех организмов огромна. И.П. Павлов писал: «Ферменты есть, так сказать, первый акт жизненной деятельности. Все химические процессы направляются в теле именно этими веществами, они есть возбудители всех химических превращений. Все эти вещества играют огромную роль, они обусловливают собою те процессы, благодаря которым проявляется жизнь, они и есть в полном смысле возбудители жизни».

Раздел биохимии, изучающий биологические катализаторы белковой природы, называется энзимологией. Круг вопросов, изучаемых энзимологией, весьма разнообразен. Он включает выделение и очистку ферментов с целью установления их состава и молекулярной структуры; изучение условий и скорости действия ферментов, а также влияния на них разнообразных физических и химических факторов.

К настоящему времени изолировано около 2000 ферментов из различных растительных и животных объектов, в том числе и микроорганизмов.

Строение и механизм действия ферментов

Строение ферментов

Ферменты, или энзимы, – биологические катализаторы белковой природы, которые ускоряют реакции, необходимые для функционирования живых организмов. Как и другие белки, ферменты имеют первичную, вторичную, третичную и часто четвертичную структуру. По строению ферменты делятся на простые (однокомпонентные) и сложные (двухкомпонентные). Простой фермент состоит только из белковой части. Сложный фермент, иначе называют холоферментом, состоит из белковой части – апофермента и небелковой – кофермента. Роль некоторых коферментов играют витамины или вещества, построенные с участием витаминов В₁, В₂, В₅, В₆, В₁₂, Н, Q и др. Особенностью сложных ферментов является то, что отдельно апофермент и кофермент не обладают каталитической активностью.

В составе как простого, так и сложного фермента, выделяют субстратный, аллостерический и каталитический центры.

Каталитический центр простого фермента представляет собой уникальное сочетание нескольких аминокислотных остатков, расположенных на разных участках полипептидной цепи. Образование каталитического центра происходит одновременно с формированием третичной структуры белковой молекулы фермента. Чаще всего в состав каталитического центра простого фермента входят остатки серина, цистеина, тирозина, гистидина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Субстратный центр простого фермента – это участок белковой молекулы фермента, который отвечает за связывание субстрата. Субстратный центр образно называют «якорной площадкой», где субстрат прикрепляется к ферменту за счёт различных взаимодействий между определёнными боковыми радикалами аминокислотных остатков и соответствующими группами молекулы субстрата.

В простых ферментах субстратный центр может совпадать с каталитическим; тогда говорят об активном центре фермента.

Аллостерический центр представляет собой участок молекулы фермента, в результате присоединения к которому какого-то низкомолекулярного вещества изменяется третичная структура белковой молекулы фермента, что влечёт за собой изменение его активности. Аллостерический центр является регуляторным центром фермента.

В сложных ферментах роль каталитического центра выполняет кофермент, который связывается с апоферментом в определённом участке – кофермент связывающем домене. Понятия субстратного и аллостерического центров для сложного и для простого фермента аналогичны.

Механизм действия ферментов

Механизм действия простого и сложного ферментов одинаков, так как активные центры в их молекулах выполняют сходные функции. Основы механизма действия ферментов были изучены в начале ХХ в. В 1902 г. английский химик А. Браун высказал предположение о том, что фермент, воздействуя на субстрат, должен образовать с ним промежуточный фермент – субстратный комплекс. Одновременно и независимо от А. Брауна это же предположение высказал французский учёный В. Анри. В 1913 г. Л. Михэлис и М. Ментэн подтвердили и развили представления о механизме действия ферментов, который можно представить в виде схемы:

Е + S  [Е ∙S]^/  [Е ∙S]^/ [Е ∙P] E + P,

где Е – фермент, S – субстрат, Р – продукт.

На первой стадии ферментативного катализа происходит образование фермент-субстратного комплекса, где фермент и субстрат могут быть связаны ионной, ковалентной или иной связью образование комплекса Е ∙ S происходит практически мгновенно.

На второй стадии субстрат под воздействием связанного с ним фермента видоизменяется и становится более доступным для соответствующей химической реакции. Эта стадия определяет скорость всего процесса.

На третьей стадии происходит химическая реакция, в результате которой образуется комплекс продукта реакции с ферментом.

Заключительным процессом является высвобождение продукта реакции из комплекса.

Свойства ферментов и их классификация

Свойства ферментов

Ферменты и катализаторы неорганической природы подчиняются общим законам катализа и имеют сходные признаки:

- катализируют только энергетически возможные реакции;

- не изменяют направление реакции;

- не расходуются в процессе реакции;

- не участвуют в образовании продукта реакции.

Ферменты обладают всеми свойствами белков, но по ряду признаков отличаются от белков, выполняющих другие функции в клетке, и катализаторов неорганической природы.

Зависимость активности ферментов от температуры. Температура может по-разному влиять на активность фермента. При высоких температурах может происходить денатурация белковой части фермента, что негативно сказывается на его активности. При определённых (оптимальных) значениях температура может влиять на скорость образования фермент-субстратного комплекса, вызывая увеличение скорости реакции. Температура, при которой каталитическая активность фермента максимальна, называется температурным оптимумом фермента. Различные клеточные ферменты имеют собственные температурные оптимумы, которые определяются экспериментально. Для ферментов животного происхождения температурный оптимум находится в интервале 40 - 50°С.

Зависимость активности фермента от рН-среды. Большинство ферментов проявляет максимальную активность при значениях рН, близких к нейтральным. Лишь отдельные ферменты «работают» в сильно кислой или сильно щелочной среде. Например, активность пепсина – фермента, гидролизующего белки в желудке, – максимальна при рН 1,5 – 2,5. В щелочной среде «работают» ферменты, локализованные в кишечнике. Изменение оптимального для данного фермента значения рН-среды может привести к изменению третичной структуры фермента, что скажется на его активности. С другой стороны, при изменении рН может измениться ионизация субстрата, что повлияет на образование фермент-субстратного комплекса.

Специфичность действия ферментов – одно из главных их свойств. Специфичность – это избирательность фермента по отношению к субстрату (или субстратам). Каждый фермент катализирует единственную реакцию либо группу реакций одного типа.

Высокая каталитическая эффективность – скорость ферментативного катализа намного выше, чем небиологического. Единственная молекула фермента может катализировать от тысячи до миллиона молекул субстрата за 1 минуту. Например, одна молекула каталазы за одну секунду разлагает около 50 000 молекул пероксида водорода.

Влияние на активность ферментов активаторов и ингибиторов. Ферменты являются катализаторами с регулируемой активностью, чего нельзя сказать о катализаторах иной природы. Это уникальное свойство ферментов позволяет изменять скорость превращения веществ в организме в зависимости от условий среды, т. е. приспосабливаться к действию различных факторов. К числу факторов, повышающих активность ферментов, относятся катионы металлов и некоторые анионы. Чаще всего активаторами ферментов являются катионы Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, K⁺, Co²⁺, а из анионов Cl^-. Катионы действуют на ферменты по-разному. В одних случаях они облегчают образование фермент-субстратного комплекса, в других – способствуют присоединению кофермента к апоферменту, либо присоединяются к аллостерическому центру фермента и изменяют его третичную структуру, в результате чего субстратный и каталитический центры приобретают наиболее выгодную для осуществления катализа конфигурацию.

Ингибиторы тормозят действие ферментов. Ингибиторами могут быть как эндогенные, так и экзогенные вещества. Механизмы ингибирующего действия различных химических соединений разнообразны.

Классификация ферментов

В настоящее время известно более 2000 ферментов. Все ферменты разделены на шесть классов, каждый из которых имеет строго определённый номер.

1. Оксидоредуктазыкатализируют окислительно-восстановительные процессы.

2. Трансферазы катализируют реакции переноса функциональных групп и молекулярных остатков с одной молекулы на другую.

3.Гидролазы катализируют реакции гидролаза.

4.Лиазыкатализируют реакции отщепления (кроме атомов водорода) с образованием двойной связи, а также негидролитический распад органических соединений либо синтез без участия макроэргических веществ.

5. Изомеразы катализируют процессы изменения геометрической или пространственной конфигурации молекул.

6. Лигазы катализируют реакции синтеза, сопровождающиеся гидролизом богатой энергией связи (как правило АТФ).

Классы ферментов делятся на подклассы, а подклассы, в свою очередь, на подподклассы. Подклассуточняет действие фермента, так как указывает в общих чертах на природу химической группы субтрата. Подподклассещё более конкретизирует действие фермента, уточняя природу атакуемой связи субстрата или природу акцептора, который участвует в реакции.

Система классификации предусматривает для каждого фермента специальный шифр, состоящий из четырёх кодовых чисел, разделённых точками. Первая цифра в шифре обозначает номер класса, вторая – номер подкласса, третья – подподкласса и четвёртая – порядковый номер в данном подподклассе. Так, лактатдегидрогеназа имеет шифр КФ 1.1.1.27, т.е. относится к первому классу, первому подклассу, первому подподклассу и занимает 27-е место в перечне ферментов упомянутого подподкласса.

Применение ферментов в различных производствах и в быту

Высокая каталитическая активность, специфичность и разнообразие ферментов, их способность осуществлять биохимические реакции в мягких условиях делают ферменты весьма привлекательными для осуществления различных технологических процессов. Эти же особенности открывают перспективу их использования в качестве медицинских препаратов.

В настоящее время препараты разных ферментов использу­ют более чем в 25-ти отраслях промышленности, главным образом в пищевой и лёгкой промышленности. Широко применяют ферменты в спиртовой промышленности и в пивоваре­нии. Начинают также применять фермен­ты при очистке сточных вод и водопроводных труб.

В се­льском хозяйстве ферменты применяются для приготовления кормов, а также улучшения их усвоения животными. Значение биокатализа для сельского хозяйства исключительно велико. Так, процесс превращения не усвояемых растениями форм органических соединений почвы и удобрений (перегной, навоз, зелёные удобрения) в усвояемые идёт ферментативным путем. Ферменты играют большую роль при прорастании зерна.

Ферменты сохраняют свои свойства и вне организма, поэтому их успешно используют в различных производствах и в быту. Например, протеазы, расщепляющие белки, используют в пищевой промышленности: фермент папаин (из сока папайи) – в пивоварении на этапах процесса, регулирующего качество пены; в мясной промышленности – для умягчения мяса.

Фермент пепсин применяется при производстве «готовых» каш и как лекарственный препарат, способствующий пищеварению; трипсин – при производстве продуктов для детского питания; реннин (сычужный фермент из желудка телёнка) – в сыроделии.

Производство кисломолочных продуктов, например, простокваши, основано на химическом превращении лактозы (то есть молочного сахара) с помощью лактазы в молочную кислоту.

В современной пищевой промышленности ферменты применяются не только для ускорения реакций, но и для торможения некоторых процессов. Особенно актуальны ферменты в таких производствах, как виноделие, изготовление спирта, кисломолочной продукции, пивоварение, хлебопечение, сыроделие и некоторые другие.

Каталаза широко применяется в пищевой и резиновой промышленности, а расщепляющие полисахариды целлюлазы и пектиназы – для осветления фруктовых соков.

В пищевых технологиях используют в основном ферменты, присутствующие в пищевом сырье, которые поступают в организм человека при потреблении свежих фруктов и овощей, орехов, молока, сброженных и консервированных продуктов. В пищевых продуктах ферментов содержится мало – миллиграммы на килограмм продукта. При кулинарной и технологической обработке пищевых продуктов ферменты, как правило, инактивируются.

В текстильной промышленности пектолитические ферменты микроорганизмов давно и широко применяются для переработки льносоломы и получения из неё волокна.  Амилолитические препараты используются для удаления клея из тканей (расшлихтовка). Некоторые протеиназы, в частности протосубтилин, используются для обесклеивания шёлка (удаления серицина) и высвобождения шёлковых волокон, состоящих из фиброина. Для освобождения шёлкового волокна от жира применяют препараты липаз.

В кожевенной промышленности микробные протеиназы используют для обезволашивания шкур и умягчения кожи. Применение комплексного ферментного препарата, состоящего из протеазы и липазы, ускоряет процесс и позволяет получить высококачественную шерсть.

Ферменты широко используются в косметической промышленности, входят в состав кремов.

Новой, быстро развивающейся и важной областью использо­вания ферментов является их применение для получения высоко­эффективных моющих средств. Например, в стиральных порошках содержатся добавки амилазы, которая расщепляет крахмал, протеазы, расщепляющие белки или белковые загрязнения, и липазы, очищающие ткани от жира и масла. Как правило, в состав стирального порошка входит комбинация этих ферментов, то есть ферментные препараты усиливают действие друг друга.

Учёные подсчитали, что добавление ферментов в стиральные порошки на 30-35% увеличивает моющую способность данного порошка.

Применение любых ферментов строго регулируется действующими гигиеническими правилами и нормами. Получают их на основе некоторых органов и тканей строго от здоровых растений и животных. Если фермент имеет микробиологическое происхождение, присутствие жизнеспособных продуцентов категорически недопустимо.

Если же они отличаются бактериальным происхождением, то должна быть исключена антибиотическая активность.

Когда речь идёт о препаратах с грибным происхождением, в их составе не может быть никаких микотоксинов.

В настоящее время развивается новая отрасль науки – промышленная энзимология, являющаяся основой биотехнологии. Фермент, ковалентно присоединённый («пришитый») к любому органическому или неорганическому полимерному носителю (матрице), называют иммобилизованным.

Техника иммобилизации ферментов допускает решение ряда ключевых вопросов энзимологии: обеспечение высокой специфичности действия ферментов и повышения их стабильности, простоту в обращении, возможность повторного использования, применение их в синтетических реакциях в потоке.

Применение подобной техники в промышленности получило название инженерной энзимологии. Ряд примеров свидетельствует об огромных возможностях инженерной энзимологии в различных областях промышленности, медицины, сельского хозяйства.

В частности, иммобилизованную β-галактозидазу, присоединённую к магнитному стержню-мешалке, используют для снижения содержания молочного сахара в молоке, т. е. продукта, который не расщепляется в организме больного ребёнка с наследственной непереносимостью лактозы. Обработанное таким образом молоко, кроме того, хранится в замороженном состоянии значительно дольше и не подвергается загустеванию.

Разработаны проекты получения пищевых продуктов из целлюлозы, превращения её с помощью иммобилизованных ферментов – целлюлаз – в глюкозу, которую можно превратить в пищевой продукт – крахмал.

Благодаря активному применению в рамках пищевых производств тех или иных ферментов, многие классические технологии были усовершенствованы и доработаны. Это позволило обеспечить не только значительный экономический эффект, но и возможность изготовления ряда совершено новых продуктов.

Несомненно, имеет большое будущее моделирование при помощи инженерной энзимологии  процесса фотосинтеза, т.е. природного процесса фиксации СО₂; помимо иммобилизации, этот жизненно важный для всего человечества процесс потребует разработки новых оригинальных подходов и применения ряда специфических иммобилизованных коферментов.

Достижения энзимологии находят всё большее применение в медицине, в частности в профилактике, диагностике и лечении болезней. Успешно развивается новое направление энзимологии – медицинская энзимология, которая имеет свои цели и задачи, специфические методологические подходы и методы исследования. Медицинская энзимология развивается по трём главным направлениям, хотя возможности применения научных достижений энзимологии в медицине теоретически безграничны, в частности в области энзимопатологии, энзимодиагностики и энзимотерапии.

Область исследований энзимопатологии является теоретической, фундаментальной частью патологии. Она призвана изучать молекулярные основы развития патологического процесса, основанные на данных нарушения механизмов регуляции активности или синтеза индивидуального фермента или группы ферментов. Обладая высокой каталитической активностью и выраженной органотропностью, ферменты могут быть использованы в качестве самых тонких и избирательных инструментов для направленного воздействия на патологический процесс.

Как известно, из более чем 5000 наследственных болезней человека молекулярный механизм развития выяснен только у 2-3 десятков. Считают, что развитие болезни чаще всего связано с наследственной недостаточностью или полным отсутствием синтеза одного-единственного фермента в организме больного. Иногда болезни называют также энзимопатиями.

Так, галактоземия – наследственное заболевание, при котором наблюдается ненормально высокая концентрация галактозы в крови.

Болезнь развивается в результате наследственного дефекта синтеза фермента гексозо-1-фосфат-уридилтрансферазы, катализирующего превращение галактозы в легко метаболизируемую глюкозу.

Причиной другого наследственного заболевания – фенилкетонурии, сопровождающегося расстройством психической деятельности, является потеря клетками печени способности синтезировать фермент, катализирующий превращение фенилаланина в тирозин.

Для диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей широко применяются отдельные ферментные тесты, выгодно отличающиеся от других химических диагностических тестов, используемых в клинике, высокой чувствительностью и специфичностью. Известно около 20 тестов, основанных на количественном определении активности ферментов (и изоферментов), главным образом в крови (реже в моче), а также в биоптатах (кусочки тканей, полученные при биопсии).

Следует отметить, что из огромного числа ферментов (более 3500), открытых в природе (частично и в организме человека), в диагностической энзимологии используется лишь ограниченный набор ферментов и для весьма небольшого числа болезней (гепатиты, инфаркт миокарда, органические поражения почек, поджелудочной железы, печени и др.).

Так, уровень липазы, амилазы, трипсина и химотрипсина в крови резко увеличен при сахарном диабете, злокачественных поражениях поджелудочной железы, болезнях печени и др. Резко повышается в сыворотке крови уровень двух аминотрансфераз, креатинкиназы (и её изо-форм) и лактатдегидрогеназы (и её изоформ) при инфаркте миокарда; умеренно повышено их содержание при поражениях тканей мозга и печени.

В последнее время стали применять ферменты рестрикции – специфические эндонуклеазы, катализирующие разрывы межнуклеотидных связей ДНК, для диагностики фенилкетонурии и других наследственных болезней человека.

Третье направление медицинской энзимологии – энзимотерапия, т. е. использование ферментов и модуляторов (активаторов и ингибиторов) действия ферментов в качестве лекарственных средств, имеет пока небольшую историю. Некоторые протеиназы: пепсин, трипсин, химотрипсин и их смеси (абомин, химопсин), ферменты групп амилаз и липаз, расщепляющие соответственно крахмал и жиры, как правило, входят в состав комбинированных препаратов, таких как фестал и панзинорм, применяют для лечения ряда болезней желудочно-кишечного тракта.

Помимо протеиназ, ряд других ферментов, в частности РНКаза, ДНКаза, гиалуронидаза, коллагеназы, эластазы отдельно или в смеси с протеиназами используются при ожогах, для обработки ран, воспалительных очагов, устранения отёков, гематом, келоидных рубцов, кавернозных процессов при туберкулезе лёгких и др. Ферменты применяются также для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, растворения сгустков крови. В нашей стране разработан первый в мире препарат иммобилизованной стрептокиназы, рекомендованный для лечения инфаркта миокарда. Калликреины – ферменты кининовой системы используются для снижения кровяного давления.

Исследование условий проявления каталитической активности

ферментов на примере каталазы и амилазы слюны

Мы решили исследовать условия проявления каталитической активности ферментов на примере каталазы и амилазы слюны, чтобы выяснить, какие факторы влияют на их активность.

Исследование условий проявления каталитической активности каталазы

Каталаза – фермент класса оксидоредуктаз из группы гидропероксидаз, катализирующий окислительно-восстановительную реакцию, в ходе которой из двух молекул пероксида водорода образуются вода и кислород:

каталаза

2Н₂О₂ 2Н₂О+ О₂

Функция каталазы сводится к разрушению токсической перекиси водорода, образующейся в ходе различных окислительных процессов в живых организмах.

Накопление перекиси водорода в клетке оказывает вредное действие на клетку. Каталаза выполняет, таким образом, очистительную функцию. 

Для исследования каталитической активности каталазы мы взяли 6 пробирок под номерами 1-6, 3%-ный раствор пероксида водорода, кусочки сырого и варёного картофеля, кусочки сырого и варёного мяса.

В 1-ю пробирку поместили немного речного песка, во 2-ю – кусочек сырого картофеля, в 3-ю – кусочек варёного картофеля, в 4-ю – кусочек сырого мяса, в 5-ю – кусочек варёного мяса, в 6-ю – измельчённый сырой картофель.

В каждую из пробирок прилили немного пероксида водорода. Наблюдали за тем, что будет происходить в каждой пробирке. В таблице 1 приведены результаты опыта.

Таблица 1–Исследование условий проявления каталитической

активности каталазы

№ пробирки	Исследуемый объект	Признаки реакции
1	Речной песок	Слабое выделение газа
2	Сырой картофель	Интенсивное выделение газа
3	Варёный картофель	Изменений нет
4	Сырое мясо	Интенсивное выделение газа
5	Варёное мясо	Изменений нет
6	Измельчённый сырой картофель	Очень интенсивное выделение газа

На основании данного опыта по интенсивности выделения газа можно сделать следующие выводы:

Каталаза активна только в живых клетках. В мёртвых тканях (варёных) в результате действия высокой температуры происходит денатурация фермента каталазы, что приводит к разрушению активного центра фермента, поэтому внешних изменений в пробирках с варёными объектами не наблюдается.

Измельчение ткани влияет на скорость катализа, так как увеличивается площадь поверхности соприкосновения субстрата с ферментом, в результате чего в пробирке № 6 наблюдается самое интенсивное выделение газа.

Реакция с речным песком (SiO₂) доказала, что неорганические катализаторы действуют менее эффективно, чем ферменты. Результаты исследования представлены на рис. 1.

Рис. 1 – Исследование условий проявления каталитической активности каталазы

Исследование условий проявления каталитической активности амилазы

Изучение влияния различных факторов на скорость ферментативного катализа мы проводили, используя фермент слюны – амилазу.

Амилаза (от лат. amylum – крахмал) – фермент класса гидролаз, секретируется слюнными железами и поджелудочной железой. В ротовой полости пища измельчается при пережёвывании, смачиваясь при этом слюной. Слюна на 99 % состоит из воды и обычно имеет рН 6,8 -7,0. В ротовой полости не может происходить полное расщепление крахмала, так как действие фермента на крахмал кратковременно.

Действие амилазы слюны прекращается в резко кислой среде содержимого желудка (рН 1,5–2,5). Однако внутри пищевого комка активность амилазы может некоторое время сохраняться, пока рН не изменится в кислую сторону.

Воздействие слюны на крахмал называют ферментативным гидролизом. Именно амилаза расщепляет крахмал на более мелкие составляющие. Этот процесс каждый человек ощущает при долгом пережёвывании крахмалосодержащих продуктов, например, хлеба. Ведь через некоторый промежуток времени можно ощутить сладковатый привкус во рту, что свидетельствует о том, что гидролиз крахмала начался, и он постепенно распадается на более простые углеводы.

Одним из важнейших углеводов для человеческого организма является глюкоза. При окислении её в каждой клетке человеческого организма образуется вода и углекислый газ. Эта реакция также сопровождается выделением энергии, столь необходимой для функционирования всех органов. Лишняя глюкоза, получившаяся при гидролизе крахмала, превращается в запасное вещество гликоген, который откладывается «про запас» в печени.

Амилаза катализирует гидролиз гликозидной связи крахмала и гликогена, расщепляя их сначала до декстринов, а затем до мальтозы. Крахмал с йодом даёт синее окрашивание. Декстрины в зависимости от размера дают разное окрашивание – от фиолетового до красно-бурого.

Влияние рН среды на активность амилазы

В каждую из трёх пробирок добавили по 10 капель 0,5%-ного раствора крахмала и по 2 капли слюны, разведённой 10 раз (1 капля слюны и 9 капель воды). В первую пробирку добавили 8 капель дистиллированной воды, во вторую – 2 капли раствора 3 %-ного соляной кислоты, в третью – 2 капли 3 %-ного раствора гидроксида натрия. Содержимое пробирок хорошо перемешали и поставили в водяную баню при температуре 37-38ºС. Через 5 мин из первой пробирки (рН в ней должно быть наиболее оптимально для действия амилазы) взяли контрольную пробу для реакции с йодом. При получении синего окрашивания, пробу повторили через 5 мин. Когда в пробе получили красное или жёлтое окрашивание, во все пробирки добавили по 1 капле 0,1%-ного раствора йода, их содержимое перемешали и зафиксировали окраску. Результаты опыта оформлены в табл. 2.

Таблица 2 – Влияние рН среды на активность амилазы

№ пробирки	Содержимое пробирок	рН среды	Окраска с йодом
1	Крахмал, слюна, вода	≈7	синее окрашивание исчезает со временем
2	Крахмал, слюна, соляная кислота	≈1	синее окрашивание не исчезает
3	Крахмал, слюна, гидроксид натрия	≈8	синее окрашивание исчезает со временем

Синий цвет в пробирке № 2 говорит о том, что кислота угнетающе повлияла на активность амилазы и помешала ей расщепить крахмал. Амилаза работает в слабощелочной среде ротовой полости, кислая среда приводит к нарушению работы фермента. Гидроксид натрия, создавая щелочную среду, способствует проявлению активности амилазы, поэтому в пробирках № 1 и № 3 произошло расщепление крахмала и синее окрашивание исчезло со временем (рис. 2).

Рис. 2 – Влияние рН среды на активность амилазы

Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы

Взяли четыре пробирки и налили в первую – 10 капель дистиллированной воды, во вторую – 8 капель дистиллированной воды и 2 капли 1%-ного раствора хлорида натрия, в третью – 8 капель дистиллированной воды и 2 капли 1%-ного раствора медного купороса, в четвёртую – 8 капель дистиллированной воды и 2 капли этанола. В каждую пробирку добавили по 10 капель слюны, разведённой 5 раз (2 капли слюны и 8 капель воды) и по 10 капель 0,5%-ного раствора крахмала. Содержимое пробирок хорошо перемешали и оставили при комнатной температуре.

В четыре другие пробирки налили по 10 капель дистиллированной воды и по 1 капле 0,1%-ного раствора йода. Через 5 мин. из каждой пробирки, в которой проводили опыт, отобрали по 2–3 капли содержимого и перенесли в пробирки с йодом. Различная окраска при реакции с йодом, а, следовательно, разная степень гидролиза крахмала обусловлена разной скоростью ферментативного катализа при добавлении различных веществ. Результаты опыта представлены в табл. 3.

Таблица 3–Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы

№ пробирки	Содержимое пробирок	Окраска с йодом
1	Крахмал, слюна, вода	Синее окрашивание исчезает со временем
2	Крахмал, слюна, NaCl	Синее окрашивание исчезает быстрее, чем с водой
3	Крахмал, слюна, CuSO4	Синее окрашивание не исчезает
4	Крахмал, слюна, этиловый спирт	Синее окрашивание не исчезает

Хлорид-ионы (Cl^-) активируют амилазу, поэтому синее окрашивание в пробирке № 2 исчезает быстрее, чем в пробирке с водой, следовательно, поваренная соль (NaCl – хлорид натрия) повышает активность амилазы, является активатором для амилазы слюны. Теперь становится понятным, почему добавление соли в пищу – кулинарный приём, который не только улучшает вкусовые качества пищи, но и способствует перевариванию сложных углеводов в ротовой полости.

Сульфат меди (II) угнетающе воздействует на активность этого фермента. Все соли тяжёлых металлов, например, соли меди, свинца, ртути и других тяжёлых металлов снижают активность фермента, вызывают денатурацию белка.

Этиловый спирт также снижает активность фермента амилазы, является ингибитором, что доказывает вредное влияние алкоголя на процесс пищеварения, поэтому в пробирках № 3 и № 4 не происходит расщепление крахмала, и длительное время остаётся синее окрашивание с йодом (рис. 3).

Рис. 3 – Влияние активаторов и ингибиторовна активность амилазы

Под влиянием внешних факторов (температуры, механического воздействия, действия химических реагентов и др. факторов) происходит изменение нативной пространственной структуры белковой молекулы – денатурация, что приводит к разрушению активного центра фермента.

На основании проделанных опытов мы подтвердили основные свойства ферментов: высокая каталитическая эффективность– скорость ферментативного катализа намного выше, чем небиологического; ферменты проявляют наибольшую активность при сравнительно низких температурах (37-50 ⁰С) и строго определённых значениях рН-среды (для амилазы слюны 7). Ферменты являются катализаторами с регулируемой активностью: активаторы ферментов способствуют увеличению скорости катализа, ингибиторы – замедляют каталитические реакции.

Заключение

Изучив литературные и электронные источники о ферментах, мы узнали, что с деятельностью ферментов человечество знакомо очень хорошо с глубокой древности, хотя и не догадывалось об этом, приготавливая хлеб, вина, пиво, сыр, в которых основную роль играют процессы брожения.

Термин фермент (от лат. fermentum – закваска) был предложен в начале ХVII в. голландским учёным Ван-Гельмонтом для веществ, влияющих на спиртовое брожение. Позднее Вилли Кюне ввёл термин энзим: слова «фермент» и «энзим» означают одно и то же – закваску: fermentum – на латыни, ζύμη или ἔνζυμον – по-гречески. 

Изучая строение ферментов, мы поняли, что ферменты, или энзимы, – биологические катализаторы белковой природы, которые ускоряют реакции, необходимые для функционирования живых организмов. Как и другие белки, они имеют первичную, вторичную, третичную и часто четвертичную структуру. По строению ферменты делятся на простые – однокомпонентные и сложные (холоферменты) – двухкомпонентные. Простой фермент имеет только белковую часть; сложный фермент – белковую часть – апофермент и небелковую – кофермент.

В составе как простого, так и сложного фермента, выделяют субстратный, аллостерический и каталитический центры.

Раскрывая механизм действия простого и сложного ферментов, выяснили, что он для них одинаков, так как активные центры в их молекулах выполняют сходные функции. Английский химик А. Браун высказал предположение о том, что фермент, воздействуя на субстрат, должен образовать с ним промежуточный фермент – субстратный комплекс. На последующих стадиях происходит химическая реакция, в результате которой образуется комплекс продукта реакции с ферментом и заключительным процессом является высвобождение продукта реакции и фермента в неизменном виде из комплекса.

Изучив свойства ферментов, мы уяснили, что ферменты и катализаторы неорганической природы подчиняются общим законам катализа и имеют сходные признаки, но по ряду признаков ферменты отличаются от белков, выполняющих другие функции в клетке, и катализаторов неорганической природы.

Для ферментов характерна высокая каталитическая эффективность, специфичность действия. Оптимальная активность ферментов проявляется при более низких температурах и при строго определённых значениях рН-среды, они являются катализаторами с регулируемой активностью: на них влияют активаторы и ингибиторы.

Изучая классификацию ферментов, узнали, что все ферменты разделены на шесть классов, каждый из которых имеет строго определённый номер: 1. Оксидоредуктазы; 2. Трансферазы; 3. Гидролазы; 4. Лиазы; 5. Изомеразы; 6. Лигазы.

Классы ферментов делятся на подклассы, а подклассы, в свою очередь, на подподклассы. Подкласс уточняет действие фермента, так как указывает в общих чертах на природу химической группы субтрата. Подподклассещё более конкретизирует действие фермента, уточняя природу атакуемой связи субстрата или природу акцептора, который участвует в реакции.

Анализируя применение ферментов, узнали, что в настоящее время препараты разных ферментов использу­ют более чем в 25-ти отраслях промышленности, главным образом в пищевой и лёгкой промышленности, а также в текстильной, кожевенной, резиновой, косметической промышленности, в сельском хозяйстве, в бытовой химии.

Достижения энзимологии находят всё большее применение в медицине, в частности в профилактике, диагностике и лечении болезней.

Медицинская энзимология развивается по трём главным направлениям: в области энзимопатологии, энзимодиагностики и энзимотерапии.

Считают, что развитие некоторых болезней чаще всего связано с наследственной недостаточностью или полным отсутствием синтеза одного единственного фермента в организме больного. Иногда такие болезни называют также энзимопатиями.

Нами были выявлены условия проявления каталитической активности ферментов на примере каталазы и амилазы слюны. На основании проделанных опытов мы подтвердили основные свойства ферментов: высокая каталитическая эффективность– скорость ферментативного катализа намного выше, чем небиологического; ферменты проявляют наибольшую активность при сравнительно низких температурах (37-50 ⁰С) и строго определённых значениях рН-среды (для амилазы слюны 7). Ферменты являются катализаторами с регулируемой активностью: активаторы ферментов способствуют увеличению скорости катализа, ингибиторы – замедляют каталитические реакции.

В качестве активаторов амилазы слюны выступают хлорид-ионы (Cl^-), ингибиторами амилазы являются соли тяжёлых металлов, этиловый спирт.

С результатами исследования мы познакомили студентов и составили сводную таблицу, в которой поместили информацию о классах ферментов и их применении.

Таким образом, цель и задачи проекта достигнуты.

Список использованных источников

1. Березовская, В.А. Биохимия: лабораторный практикум [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://window.edu.ru/catalog/pdf2txt/540/68540/42319?p_page=6 (дата обращения: 06.02.2020).

2. Большая советская энциклопедия. Каталаза [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://dic.academic.ru/dic.nsf/bse/94212/ (дата обращения: 21.01.2020).

3. Габриелян, О. С. Химия. Углублённый уровень. 10 кл.: учебник Текст / О.С. Габриелян, И. Г. Остроумов, С. Ю. Пономарев. – Москва: Дрофа, 2017. – 368 с.

4. Нобелевские лауреаты: Эдуард Бухнер. Учёный, узнавший, как получается спирт [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://indicator.ru/chemistry-and-materials/nobelevskie-laureaty-eduard-buhner.htm(дата обращения: 26.01.2020).

5. Области применения ферментов [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.enzyme.chem.msu.ru/cellulas/Appl_ru.html (дата обращения: 06.02.2020).

6. Применение ферментов [Электронный ресурс]. – Режим доступа:http://www.xumuk.ru/biologhim/059.html (дата обращения: 18.01.2020).

7. Проблемы медицинской энзимологии [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.xumuk.ru/biologhim/060.html (дата обращения: 19.01.2020).

8. Проскурина, И. К. Биохимия [Текст]: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / И. К. Проскурина. – Москва: ВЛАДОС-ПРЕСС, 2001. – 240 с.

9. Справочник химика 21. Химия и химическая технология. Амилаза слюны [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://chem21.info/info/186786/ (дата обращения: 15.02.2020).

Код для цитирования: Скопировать