XIII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2021

Введение

Аспергилл содержит сотни форм и широко распространен в различных климатических зонах по всему миру. Виды рода Aspergillus - это конидиальные грибы, то есть грибы находятся в бесполой стадии, но с некоторыми доказательствами некоторые члены рода также могут быть временно классифицированы как Ascomycota. Представители рода Aspergillus способны расти под высоким осмотическим давлением и обладают высокой аэробной активностью, а также присутствуют практически во всех богатых кислородом средах. Поскольку грибы обычно выращиваются на субстратах с высоким содержанием углеводов, аспергиллы часто встречаются загрязняющие вещества в крахмалистых продуктах питания. В дополнение к жизни на углеродных источниках, многие виды могут выжить в среде, бедной питательными веществами. Некоторые представители рода Aspergillus могут вызывать инфекции человека и животных. Более 60 видов Aspergillus были идентифицированы как патогенные микроорганизмы и связаны с инфекциями наружного уха, поражениями кожи, язвами и тому подобным. Есть также некоторые аспергиллы, которые являются важными микробными ферментационными реакторами для производства саке или подобных ему и некоторых биологических продуктов.

Aspergillus nidulans как модельный объект в биологии

Aspergillus nidulans-это нитчатый гриб, который является потенциальным ресурсом для промышленных ферментов. Это универсальная фабрика грибковых клеток, которая может синтезировать различные промышленные ферменты, такие как целлюлазы, β-глюкозидазы, гемицеллюлазы, лакказы, липазы, протеазы, β-галактозидазы, танназы, кератиназы, кутиназы и оксидазы арилового спирта. A. nidulans продемонстрировал потенциал использования недорогих субстратов, таких как пшеничные отруби, рисовая солома, сахарный тростник багасса, рисовые отруби, сердцевина кокосовой пальмы, черный грамм остатка и куриные перья для производства ферментов экономически эффективно. А. нидуланс также известен как модельный организм для производства гетерологичных ферментов. В нескольких исследованиях сообщалось о генно-инженерных штаммах A. nidulans для производства различных ферментов. Нативные, а также гетерологичные ферменты A. nidulans использовались для различных промышленных процессов.

Ферменты имеют различные виды промышленного применения, включая целлюлозно-бумажную, прачечную, пищевую, кормовую, пивоваренную и винодельческую, текстильную и биоэнергетическую промышленность. Экономичное и эффективное промышленное производство достигается за счет использования ферментов по сравнению с химическими катализаторами. Ферменты являются высокоспецифичными и экологически чистыми и могут работать в мягких условиях Ферменты продуцируются несколькими микроорганизмами, такими как бактерии, актиномицеты и грибы, но грибы представляют большой интерес, потому что они выделяют внеклеточные ферменты в большем количестве . Нитчатые грибы, в том числе аспергиллы, широко используются для промышленного производства ферментов. A. nidulans является универсальным грибковым ресурсом, который показал потенциал для производства различных ферментов, включая целлюлазу , β-глюкозидаза , ксиланаза , лакказа , липаза , протеаза , β-галактозидаза , танназа , кератиназа , кутиназа , и оксидаза арилового спирта. Этот обзор посвящен потенциалу диких штаммов A. nidulans для нативной продукции ферментов и способности экспрессировать гетерологичные ферменты.

Грибы используются в промышленном производстве белка благодаря своей превосходной способности выделять большое количество белков. Экспрессия гетерологичных белков в нитчатых грибах широко изучена в связи с их естественной способностью продуцировать большое количество гидролитических ферментов для промышленных процессов в больших масштабах. В общей экспрессии белка выбранный ген, кодирующий целевой фермент, экспрессируется в грибковой клеточной фабрике , такой как Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei и Aspergillus nidulans .Нитевидные грибы, принадлежащие к роду Aspergillus, обычно ассоциируются с деградацией биомассы и продуцируют широкий спектр гидролаз. Aspergillus spp. считаются подходящими организмами-хозяевами для промышленного производства ферментов из-за их высокой секреционной способности, статуса GRAS (обычно считающегося безопасным), быстрого роста на недорогих средах и большого спектра производимых нативных ферментов A. nidulans был создан как модельный организм для секреции большого количества гетерологичных ферментов. Это хорошо известный нитевидный гриб, который широко используется для биоинженерных исследований. Хорошо охарактеризованы его физиология, морфология и оптимальные условия роста .В последние несколько лет было проведено несколько исследований на A. nidulans как организме-хозяине для производства различных гетерологичных ферментов, таких как липаза, ксиланаза, ксилоглюканаза (GH12), эндоксиланаза (GH11), арабинофуранозидаза (GH54) , и оксидаза арилового спирта .

Жизненный цикл A. nidulans протекает как через стадии полового, так и бесполого размножения. Они управляются различными факторами окружающей среды, такими как свет, кислород и доступность питательных веществ. Как правило, половое размножение начинается после асексуального конидирования и поощряется ограничением кислорода и отсутствием света. A. nidulans образует замкнутое плодовое тело, известное как cleistothecium. Клетки оболочки являются характерными структурами, обычно продуцируемыми некоторыми видами рода Aspergillus. эти клетки встречаются в ассоциации cleistothecia всех аскогенных видов группы Aspergillus nidulans 

Производство ферментов с помощью грибов осуществлялось в условиях твердотельной ферментации (SSF) и погружной ферментации (SmF). SmF уделялось больше внимания благодаря простоте контроля и измерения параметров ферментации, сокращению времени ферментации и основным методам сбора и очистки ферментных продуктов. В последние годы были проведены интенсивные исследования SSF, и он заслужил доверие благодаря своему низкому потреблению воды, меньшим шансам загрязнения, низким энергозатратам и высокому выходу продукта. Хотя A. nidulans показали потенциал для производства ферментов как при SSF, так и при SmF, большинство исследований сообщают о производстве ферментов A. nidulans при SmF. Параметры ферментации, такие как среда ферментации, продолжительность, рН и температура, влияют на выработку ферментов при SSF и SmF. Содержание влаги является критическим параметром при SSF, в то время как тряска или статические условия имеют решающее значение при SmF. Наличие подходящего источника азота и добавление поверхностно-активных веществ также являются важными факторами, определяющими синтез ферментов. Разработка подходящей среды для роста микроорганизмов потенциально может снизить средние затраты и улучшить производство ферментов.

Нитчатые грибы являются важными ресурсами для крупномасштабного производства ферментов. Однако уровень производства низок, и это ограничение стимулирует исследования по генным манипуляциям. Сообщается, что гетерологичная экспрессия является альтернативой увеличению выработки ферментов. Улучшенное производство ферментов удешевляет промышленные процессы, особенно в сочетании с недорогими субстратами-индукторами. A. nidulans-превосходная модельная грибковая система со стандартизированными методами генетики и биохимической характеристики любого интересующего фенотипа. Он был широко изучен для генетических манипуляций для усиленного синтеза или секреции различных типов макромолекул. A. nidulans поддается молекулярным методам, и его полный геном был секвенирован .

Был сконструирован высокоэкспрессионный вектор секреции (pEXPYR), направляющий перепроизводство клиентских белков. Этот вектор направляет белки во внеклеточную среду у A. nidulans A773 и A. awamori ATCC22342. Эта модернизированная система экспрессии секреции была использована для генерации основного набора гиперпродуктивных гемицеллюлолитических ферментов. Последовательная интеграция нескольких клиентских генов позволяет производить коктейль ферментов в пределах одного экспрессирующего хозяина. A. nidulans A773 был использован для одновременного производства ксиланазы и выделения ксилолигосахарида с использованием рисовой шелухи в качестве субстрата. Эндоксиланаза и арабинофуранозидаза, кодирующие гены Penicillium funiculosum и Aspergillus niger соответственно, были перенесены в модельный организм A. nidulans. Гиперсекреция эндоксиланазы (301,2 ЕД/мг) и арабинофуранозидазы (115,55 ЕД/мг) A. nidulans наблюдалась с использованием экспрессионной среды, содержащей пиридоксин и 2% мальтозы в качестве индуктора при 37°C. Активность эндоксиланазы и арабинофуранозидазы оценивали против арабиноксилана ржи и арабинана сахарной свеклы соответственно в качестве субстрата.  Модифицированный A. nidulans путем интеграции гена AFUMN-GH10 из Aspergillus fumigatus var. niveus для производства Эндо-β-1,4-ксиланазы. Этот генетически модифицированный A. nidulans приводил к более высокой секреции ксиланазы в присутствии мальтозы. Для оптимизации компонентов питательной среды были использованы 2-уровневая конструкция Планетта-Бирмана и 3-уровневая конструкция бокса-Бенкена, а при использовании оптимальной среды была достигнута ксиланазная активность 1620 Ед/мл (12460 ЕД/г мальтозы). Эта активность ксиланазы была на 280% выше максимальной активности с исходной основной средой. Ксилоглюканаза (AtXEG12) из Aspergillus terreus была экспрессирована в A. nidulans и очищена. Сконструированный A. nidulans с геном AtXEG12 выращивали под SmF и SSF в аэролифтном биореакторе и биореакторе колонного типа соответственно. При СМФ наибольшая активность фермента (0,45 МЕ/мл) наблюдалась через 24 ч, а максимальная активность фермента (3,15 МЕ/мл) - в условиях ССФ.

Кислую термостабильную эндоглюканазу из A. nidulans экспрессировали в Pichia pastoris, а также проводили очистку и биохимическую характеристику рекомбинантного фермента. Максимальная активность эндоглюканазы наблюдалась при температуре 50°С и РН 4,0. Рекомбинантная эндоглюканаза сохраняла 100% - ную активность при инкубации при 45 и 55°С в течение 72 ч. рекомбинантную эндоглюканазу анализировали на способность гидролизовать природные субстраты, а именно банановый стебель, шаровидную паровую жижу сахарного тростника, соевый остаток и кукурузный Стовер. Последовательность гена липазы Beauveria bassiana bbl1 была клонирована в вектор экспрессии pExpyr in-frame с сигнальным пептидом глюкоамилазы Aspergillus niger, в результате чего была получена плазмида, названная pExpyr + bbl1. A. nidulans A773 был преобразован с использованием этого вектора. Для улучшения продукции рекомбинантной липазы использовались различные источники углерода, включая кожуру маниоки, кукурузный сироп, семена сорго и пшеничные отруби. Моносахариды, такие как фруктоза и глюкоза, усиливают выработку липазы в сочетании с ранее описанными источниками углерода, особенно семенами сорго и пшеничными отрубями. A. nidulans A773 был генетически модифицирован и сверхэкспрессирует и секретирует мицелиофтору thermophila ариловый спирт оксидазу (ААО) в мальтозосодержащих средах. Этот мутантный штамм A. nidulans не способен синтезировать свой пиридоксин. Ограничение пиридоксина можно использовать для того чтобы контролировать рост клетки, отвлекая субстрат к синтезу протеина. При возбужденном брожении продукция ААО была обнаружена аналогичной, когда среды были с 1 мг/л пиридоксина и без пиридоксина. Однако лечение, в котором отсутствовал пиридоксин, должно было быть дополнено пиридоксином после 156 ч ферментации, чтобы поддерживать непрерывное производство ферментов. Использование чрезвычайно разбавленных уровней пиридоксина позволило снизить рост грибов при сохранении стабильной продукции ферментов

Заключение.

 A. nidulans  могут синтезировать различные промышленные ферменты, включая целлюлазы, ксиланазы, лакказы, липазы, протеазы, β-галактозидазы, танназы, кератиназы, кутиназы и оксидазы арилового спирта. Эти ферменты находят применение в различных отраслях промышленности, таких как пищевая, пивоваренная и винная, биотопливо, корма для животных, текстильная и прачечная, целлюлоза и бумага. A.nidulans  продемонстрировал потенциал использования недорогих субстратов, таких как пшеничные отруби, рисовая солома, сахарный тростник багасса, рисовые отруби, сердцевина кокосовой пальмы, черный грамм остатка и куриные перья для производства ферментов экономически эффективно, все эти плюсы позволяют использовать A. nidulans как модельный объект.

Список литературы:

J.-M. Choi, S.-S. Han, and H.-S. Kim “ "промышленное применение ферментного биокатализа: текущее состояние и будущие аспекты", Biotechnology Advances, vol. 33, no. 7, PP. 1443-1454, 2015 г.

А. Кумар, д. Датта, А. Гаутам, “добыча сырой фермент из гриба Aspergillus nidulans АКБ-25 через черный грамм остатков в качестве субстрата и его промышленное применение,” журнал генетической инженерии и биотехнологии, том. 14, нет. 1, стр. 107-118, 2016.

К. Танея, С. Гупта и Р. Чандер Кухад, "свойства и применение частично очищенной щелочной ксиланазы из алкалофильного гриба Aspergillus nidulans KK-99", Bioresource Technology, vol. 85, no. 1, PP. 39-42, 2002 г.

K. E. Vivekanandan, S. Sivaraj и S. Kumaresan, "характеристика и очистка фермента лакказы из Aspergillus nidulans CASVK3 из устья реки веллар юго-восточного побережья Индии", International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, vol. 3, no. 10, PP. 213-227, 2014.

https://www.creative-biolabs.com/vaccine/em-aspergillus-em-polyclonal-antibody-49627.htm?gclid=EAIaIQobChMI6aaVk56U7gIVkNGyCh26PgPjEAAYASAAEgJ49fD_BwE