XIII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2021

Введение. Одним из особо важных событий XX века в области генетики можно по истине считать определение ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). Так с момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно совершенствуются и модифицируются [3].

В настоящее время существуют различные методы, позволяющие выделять ДНК из растительной и животной ткани, грибов, бактерий, вирусов и т. д. Этап выделения преследует основную задачу, а именно получение очищенных препаратов ДНК с целью дальнейшего использования для решения широкого спектра вопросов, например таких как проведение обратной транскрипции, детектирование накопления продуктов амплификации методом ПЦР, клонирование, секвенс, гибридизация, синтез ДНК и другие [3].

С познанием организации и изменчивости генетического материала связаны разработка новых методов лесовосстановления и улучшения растений. Анализ генофонда и сохранение древесных видов лесных растений является ключевой целью работы лесной генетики. Одним из самых больших направлений работы лесной генетики является изучение гомо- и гетерозиготности, а также анализ полиморфизма ДНК. [2].

В результате анализа репродуктивного материала в базу данных вносится информация о генетических характеристиках контрольных образцов семян достоверно известного происхождения на основе ДНК-анализа. Формируется уникальный генетический код образцов семян, затем отслеживают в какие районы и области высеваются эти семена, потом отбираются сеянцы, которые также подвергаются генетическому исследованию с целью контроля качества посадочного материала [2].

Материалы и методы. При выделении ДНК из растительной ткани растений важным фактором является эффективное разрушение клеточной стенки, которая состоит из целлюлозы и других химических компонентов, таких как полисахариды, полифенолы, белки и липиды, которые действуют как загрязняющие вещества во время выделения ДНК. Многие методы, используемые для этого, приводят к сильной фрагментации ДНК по причине гидродинамических разрывов в цепи [1].

Основная цель различных методов выделения ДНК – разработка относительно быстрого, недорогого и последовательного метода выделения для извлечения высококачественной ДНК с лучшим выходом. Как правило, образцы листьев или листоподобных органов содержат большое количество полифенолов, дубильных веществ и полисахаридов. Основным принципом выделения ДНК является разрушение клеточной стенки, клеточной мембраны и ядерной мембраны для высвобождения высокоинтактной ДНК в раствор с последующим осаждением ДНК и удалением загрязняющих биомолекул, таких как белки, полисахариды, липиды, фенолы [4].

Клетки растений заключают себя в сложную полисахаридную клеточную стенку, основной составляющей которой является целлюлоза, которая имеет кристаллическую природу из-за цепочечной структуры и межмолекулярных водородных связей. Его можно ослабить, чтобы открыть стенку ячеек, применив механическую силу, действующую во время измельчения вместе с буфером CTAB (бромистого цетилтриметиламмония). Методика с использованием СТАВ впервые разработана Мюррэм и Томпсоном в 1980 году, и в последствие была опубликована Вангером в 1987 году [4; 5].

СТАВ-метод позволяет получать препараты растительной ДНК с чистотой, достаточной для ПЦР, рестрикционного и гибридизационного анализа. Данный метод хорошо растворяет мембраны клеток. Кроме того, его применение позволяет разделить ДНК и полисахариды, поскольку они отличаются по растворимости в присутствии этого поверхностно-активного вещества[1]. На рисунке 1 показано каким образом при взаимодействии клеточных мембран с буфером, содержащим СТАВ, детергент захватывает липиды и белки, освобождая ДНК [5].

Рисунок 1 – Разрушение клеточной мембраны и выделение ДНК

В общем виде схема выделения ДНК из хвои древесных растений методом СТАВ выглядит следующим образом:

1. В начале работы необходимо обработать спиртом бокс и все используемые поверхности, далее взять необходимое количество пробирок с крышками и установить на планшет, подписать их.

2. Поместить в бокс всю необходимую посуду, реактивы, расходные

материалы. Приготовленный СТАВ 3% (с указанной датой приготовления), спирт (95% этанол). Включить ультрафиолет на 15 мин. Пустые пробирки на 2 мл (подписать порядковые номера 1, 2, 3…) поместить в термостат и прогреть их при t = 65˚С.

3. СТАВ 3% подогреть на магнитной мешалке с подогревом до t = 65˚С.

4. Подготовка образцов. Хвою необходимо нарезать ножницами, предварительно протёртыми 95% этанолом и прокаленными зажигалкой. Резать на стекле или на фильтровальной бумаге. Полученный образец ткани поместить в ступку и добавить 1000 мкл прогретого до 65˚со СТАВ-буфера (3%), растереть до однородной кашицы.

5. Кашицу перелить в нагретые в термостате пробирки, после поместить их обратно в термостат. После наполнения последней пробирки подождать 2-3 мин, вынуть пробирки в красный планшет и остудить до комнатной температуры.

6. Переставить планшет с пробирками в бокс, открыть и добавить в каждую по 800 мкл смеси изоамилового спирта с хлороформом. Работать необходимо в маске. Затем закрыть пробирки крышкой и 3 мин перемешивать.

7. Переместить пробирки в центрифугу и центрифугировать 4 мин при t = 21ºC.

8. Переставить в планшет, после перенести планшет в бокс и отобрать супернатант не задевая нижнюю и среднюю фазы. После необходимо добавить холодный изопропанол. Закрыть пробирки.

9. Встряхнуть вручную 3 мин и далее центрифугировать 4 мин при Maxоборотах (21130 rcf при t = 21ºC).

10. Вынуть из центрифуги и крайне аккуратно и в то же время интенсивно вылить изопропиловый спирт, следим за осадком. Открытые пробирки переворнуть на фильтровальную бумагу для удаления лишних капель.

11. Переставить в планшет без крышки, добавить по 1000 мкл 95% этилового спирта и каждую пробирку встряхнуть на вортексе до отделения осадка и далее центрифугировать 3 мин при Maxоборотах (21130 rcf при t = 21ºC).После аккуратно слить спирт.

12. Снова добавить 1000 мкл 95% этилового спирта и после встряхнуть на вортексе, 3 мин центрифугируем при Maxоборотах (21130 rcf при t = 21ºC), слить спирт и перевернуть на фильтровальную бумагу для удаления спирта.

13. Подсушить пробирки в термостате 15 мин при t = 55ºC. После сушки необходимо смотреть, чтобы все осадки были внизу пробирки.

14. Высушенные осадки залить dH₂O в объёме 40 мкл и встряхнуть пробирки на вортексе до полного растворения высушенного осадка.

15. Пробирки поместить в термостат на 40 мин – 1 час при t = 40ºC и 1000 об., пробирки желательно встряхивать на вортексе каждые 15 мин и после того, как время закончится, ещё раз встряхнуть и открутить на вортексе.

Выводы. СТАВ-метод хорошо подходит для выделения и очистки ДНК из хвои древесных растений, так как позволяет удалить большое количество полифенолов, дубильных веществ и полисахаридов, которые отрицательно влияют на чистоту ДНК и, следовательно, на ее качество.

В заключении стоит отметить, что методики выделения ДНК зависит от многих факторов и основывается исходя из определённых критериев. Поэтому выбор определенного метода выделения ДНК до сих пор остается трудной задачей, от решения которой зависит получение правильного и надежного результата. Неверно выбранный метод выделения ДНК или его неверное осуществление могут привести либо к получению загрязненной ДНК, либо непригодной для исследования или её потеря.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. . Каюмов, А.Р. Практикум по молекулярной генетике. Учебно-методическое пособие / А.Р. Каюмов, О.А. Гимадутдинов // КФУ. – Казань. – 2016. – С.36.

2. Амяга, Е. Н. Значение генетических исследований для сохранения и воспроизводства лесных ресурсов / Е. Н. Амяга, С. В. Нифонтов // Природные ресурсы и экология дальневосточного региона. Материалы II международного научно-практического форума. – Хабаровск. – 2017. – С. 142–147. – Режим доступа: https://www.elibrary.ru/download/elibrary_29386974_55049111.pdf

3. Лубенникова, М.В. Выделение ДНК - важный этап молекулярно-генетического исследования/ М.В. Лубенникова, В.А. Афанасьев, К.А. Афанасьев // Электронный научно-методический журнал Омского ГАУ. – 2020. – №2 (21) – С.4. – Режим доступа: https://www.elibrary.ru/download/elibrary_43154546_96360452.pdf

4. Heikrujam J. The Chemistry Behind Plant DNA Isolation Protocols, Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies / Jina Heikrujam, Rajkumar Kishor, Pranab Behari // IntechOpen, DOI: 10.5772/intechopen.92206. – 2020. – Available from: https://www.intechopen.com/books/biochemical-analysis-tools-methods-for-bio-molecules-studies/the-chemistry-behind-plant-dna-isolation-protocols

5. Сомма, М. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов. Выделение и очистка ДНК //. Всемирная организация здравоохранения. Европейское региональное бюро. – 2003. – С. 20 – Режим доступа: https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/manual%20RUS/UM%20Rus-S4.pdf

Код для цитирования: Скопировать