XIII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2021

Введение

Модельные организмы — организмы, которые используются в качестве моделей для изучения различных свойств, процессов или явлений живой природы. Модельные организмы интенсивно изучаются, причем одна из причин этого — надежда на то, что открытые при их изучении закономерности окажутся свойственны и другим более или менее похожим организмам, в том числе и человеку. Часто модельные организмы используются тогда, когда проведение соответствующих исследований на человеке невозможно по техническим или этическим причинам. 

Криобиология (от греч. cryo — холод, bios — жизнь и logos — наука) — раздел биологии, в котором изучаются эффекты воздействия низких температур на живые организмы. На практике, в рамках криобиологии занимаются исследованиями биологических объектов или систем при температурах ниже нормальных. В качестве объектов могут служить: белки, клетки, ткани, органы, или целые организмы. Диапазон температур использующийся в этой области составляет от умеренно низких до криогенных (от 0°С до близких к абсолютному нулю) [1]. Современная биология развития дает возможность преодолеть экологические, поведенческие и даже межвидовые барьеры с помощью искусственного осеменения или трансплантации эмбрионов. С помощью репродуктивных технологий можно осуществить процесс оплодотворения экстракорпорально, клонировать животных и создавать химеры, в том числе межвидовые. Так же, в комплексе с методами криобиологии можно получить живое потомство от мертвых животных. Один из методов репродуктивной биологии, имеющий прямое отношение к сохранению генетических ресурсов, — криоконсервация, т.е. низкотемпературное хранение живых объектов с возможностью последующего восстановления их биологических функций [2].

Повышенный интерес к криобиологии связан с нарастающим антропогенным воздействием на водные экосистемы, что особенно сильно повлияло на состояние популяций рыб. Искусственное воспроизводство является одним из главных источников формирования и поддержания запасов ценных видов рыб. На сегодняшний день низкотемпературное консервирование является одним их наиболее доступных и приемлемых способов долгосрочного хранения клеток. Криоконсервирование эмбрионов рыб – важный этап сохранения биоразнообразия, так как в этом случае сохраняются как материнский, так и отцовский геном. До настоящего времени попытки криоконсервирования яиц и эмбрионов рыб не привели к положительным результатам. Одним из существенных факторов, затрудняющим криоконсервирование, являются крупные размеры, гетерогенность сложно устроенных многослойных мембранных комплексов, а также низкая проницаемость мембран желточного синцития и чувствительность эмбрионов к переохлаждению. Решение проблемы криоконсервирования ооцитов и эмбрионов рыб может позволить создать страховые запасы гамет и эмбрионов ценных и промысловых видов рыб, а также предотвратить их исчезновение в результате массовых эпизоотий. Это особенно важно для редких и исчезающих видов.

Характеристика

В качестве перспективного модельного объекта в криобиологии выступает ля́лиус - (лат. Colisa lalia) — вид небольших лабиринтовых рыб из семейства макроподовых (Osphronemidae), обитающая в реках Индии (Бенгалия, Ассам). Лялиус обитает в мягких, прогретых солнцем водах, держится в густых зарослях. Является распространённой аквариумной рыбой. Лялиус был описан в 1822 году шотландским зоологом Фрэнсисом Бьюкенен-Гамильтоном и впервые завезен в Европу в 1869 году [3]. Colisa lalia вырастают в длину до 5—6 см; имеют очень красивую, разноцветную окраску. Тело лялиуса плоское, верхний плавник доходит почти до хвоста, у самцов он имеет более острую форму, а у самок – округлую. Хвост закругленный, боковые плавники нитеобразные и прозрачные, они играют роль органов осязания, поскольку зрение у лялиусов не слишком хорошее. При помощи этих «усов» они ощупывают дно и могут обходить препятствия – такие изменения вызваны тем, что естественной средой их обитания является мутная вода. Тело лялиуса покрыто рядом полос, все плавники, за исключением боковых, также пятнистые. У самки усики зачастую желтее, а у самца красные. [1].

Использование в качестве модельного объекта

Основными модельными объектами, на которых проводились эксперименты по подготовке эмбрионов рыб к замораживанию, служили эмбрионы Brachidanio rerio, Carassius auratus, Cyprinus carpio, диаметр оплодотворенной икринки которых соответствовал 1,2–2,5 мм. В ходе экспериментов [5] была показана достаточно низкая выживаемость эмбрионов при обработке их такими криопротекторами, как диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин (Гл), метанол (МЕ), и их комбинациями. Из-за с низкой проницаемости хориона и эмбриональных мембран увеличивается время инкубации эмбрионов в криозащитных сред. Это приводит к их гибели еще до замораживания вследствие токсичности криопротекторов.

Преимущества использования в качестве модельного объекта лялиуса (C. lalia):

Его эмбрионы намного меньше, чем у данио рерио (Brachydanio rerio) – наиболее распространенного биологического объекта в криобиологических исследованиях.

Наблюдение за эмбриогенезом и влиянием факторов эксперимента облегчается в связи с физиологическими параметрами этих эмбрионов.

Кроме того, эмбрионы C. lalia можно легко получать на разных стадиях развития в любое удобное для исследователя время года.

Преимуществами объекта также являются короткая продолжительность периода эмбрионального развития.

Немаловажным фактором является отсутствие особых трудностей при содержании в лабораторных условиях [4].

Криоконсервирование эмбрионов лялиуса.

Параметром эмбрионального развития рыб принят временной показатель одного митотического цикла в период синхронных делений дробления τ_0. Для измерения этого показателя был выбран диапазон температур 26–30 °С, который соответствует оптимальным температурам нереста лялиуса. Общее время развития до стадии выклева при температуре 28±0,2 °С составляет 24 ч (±1,0) [5].

Диаметр оплодотворенной икринки в момент первого митотического деления без хориона составляет 0,61±0,03 мм; с перивителлиновым пространством и хорионом – 0,7±0,1 мм. Большинство исследований, связанных с криоконсервированием бластомеров эмбрионов рыб, проводится на ранних стадиях развития, поскольку эмбрионы на стадии образования 2–8 бластомеров (соответствует первому часу развития) устойчивы к воздействию криопротекторов на протяжении длительного времени. Криобиологические исследования с использованием эмбрионов C. lalia на ранних стадиях развития целесообразно проводить в течение первого часа после оплодотворения. Так же, изучалась выживаемость эмбрионов лялиуса после инкубации в криозащитныхсредах [5]. Результатом исследования стал вывод о значительном влиянии на развитие эмбрионов С. lalia состава криозащитной среды и температуры инкубации. Включение в состав криозащитных сред таких криопротекторов, как АЭА, ДМФА, ФА увеличивает смертность эмбрионов после инкубации, поэтому их использование для разработки методов криоконсервирования эмбрионов рыб требует дальнейших исследований. В заключение можно сказать, что поиск криопротекторов обладающих наименьшим негативным влиянием для рекомендации их в состав криозащитных сред является актуальной проблемой.

Заключение

C. lalia, имея достаточно короткий репродуктивный цикл и период эмбрионального развития, может быть успешно использован наряду с другими биологическими объектами как лабораторная модель для криобиологических исследований. Для определения токсичности криопротекторов, влияния температуры инкубации и оптимизации процедур витрификации эмбрионов C. lalia целесообразно использовать поздние стадии их развития. А также, преимуществами является их распространенность, легкость в условиях содержания, и короткая продолжительность периода эмбрионального развития.

Список литературы:

1. Криобиология // Википедия. 2020.

2. Амстиславский С.Я. et al. Криоконсервация и сохранение биоразнообразия // Природа. 2014. № 9 (1189).

3. Лялиус // Википедия. 2020.

4. Фирсова А.В. Низкотемпературное Консервирование Яйцеклеток И Эмбрионов Рыб. Общество с ограниченной ответственностью “Амирит,” 2018. P. 271–274.

5. Выживаемость эмбрионов лялиуса (Colisa Lalia, Hamilton Buchanan, 1822) после инкубации в криозащитных средах - PDF Free Download [Electronic resource]. URL: https://docplayer.ru/154891282-Vyzhivaemost-embrionov-lyaliusa-colisa-lalia-hamilton-buchanan-1822-posle-inkubacii-v-kriozashchitnyh-sredah.html (accessed: 06.01.2021).

6. Bart A. N. New approaches in cryopreservation of fish embryos / Bart A. N. // Cryopreservation in Aquatic Species. The World Aquaculture Society. — Louisiana : Baton Rouge, 2000. — P. 179—187.