XIII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2021

Лейкоз крупного рогатого скота является одной из крупнейших и актуальнейших проблем ветеринарии настоящего времени. Если рассматривать болезнь в аспекте современных взглядов и последних достижений в области ретровирусологии, то она представляет собой общую медико-биологическую проблему, выходящую за узкие рамки ветеринарии. Принимая во внимание теоретические установки и концепции вирусного канцерогенеза, ЛКРС представляет определенный санитарно-медицинский интерес, и не случайно он изучается наряду с лейкозами и онкологическими заболеваниями людей, таких как Т-клеточный лейкоз, СПИД, возбудитель которого имеет близкое эволюционное родство и морфологическое сходство с Т-лимфотропными вирусами человека и обезьяны. Болезнь протекает бессимптомно, проявляясь на последних стадиях высоким лимфоцитозом и опухолевыми образованиями кроветворных органов и тканей. ЛКРС широко распространен во всем мире и наносит значительный экономический ущерб. В Российской Федерации лейкоз среди хронических инфекций КРС твердо занимает ведущее место, имея форму энзоотий и опережая такие болезни, как туберкулез и бруцеллез по уровню инфицированности стад.

В соответствии с правилами искоренение лейкоза заключается в выбраковке больных животных и изоляции, инфицированных с последующей постепенной заменой их здоровыми. Все поголовье крупного рогатого скота, подлежит исследованию на лейкоз с шести месячного возраста по РИД-реакции и с двух летнего возраста – гематологические. Серологические исследования по РИД проводят в возрасте 6, 12, 16, 18 месяцев. Гематологические исследования взрослому поголовью (РИД положительному) каждые шесть месяцев.Диагноз на лейкоз ставят, исходя из исследований крови на реакции иммунной диффузии (РИД), которая строго специфична. При установлении положительной реакции иммунной диффузии, животного изолируют и проводят гематологические исследования крови, которые заключаются в выявлении в периферической крови повышенного числа лейкоцитов, слабо дифференцированных клеток, а так же полиморфных атипичных клеток. При выявлении гематологических изменений в крови животных считают больными лейкозом [1].

Серологические методы. Основным серологическим методом диагностики лейкоза крупного рогатого скота является реакция иммунодиффузии в геле агара (РИД) и метод иммуноферментного анализа (ИФА). С помощью этих методов выявляют наличие в организме исследуемых животных специфические антитела, распознающих белки оболочки вируса-возбудителя. При этом метод РИД уступает ИФА по чувствительности, точности и специфичности, поскольку преципитацию специфических комплексов оценивают визуально. Наличие самого вируса-возбудителя, точнее провируса, т.е. интегрированной в геном клетки-хозяина ДНК-копии вируса, проводят с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая позволяет с большей специфичностью и чувствительностью выявлять инфицированных животных, в том числе и среди серонегативных особей. Это единственный метод, позволяющий проводить скрининг носителей вируса-возбудителя среди молодняка (до шестимесячного возраста), у которого иммунный ответ еще не выработан. Существуют и другие, более чувствительные, модификации метода ПЦР ВЛКРС как в крови, так и в молоке коров – ПЦР в режиме реального времени, гнездовая ПЦР, а также комбинированный метод ПЦР–ИФА [4].

Серологические исследования на лейкоз проводятся, когда животные достигают 6 месячного возраста и старше. Взятие проб крови осуществляется за 30 суток, либо через 30 суток после введения животным вакцин и аллергенов, исследование стельных животных за 30 суток до отѐла, или через 30 суток после него. Для исследования используется сыворотка крови испытуемого животного в количестве 2-3 мл, затем проба направляется в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают: название хозяйств, номер (кличку), возраст, пол, породу животного.

В основе РИД лежит обнаружение в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Через 2-8 недель после заражения животного ВЛКРС в крови появляются специфические антитела и сохраняются в организме в течение всей жизни.

При постановке иммуноферментного анализа отмечается иммунохимическая реакция взаимодействия антиген-антитело, в качестве индикатора в этой реакции используется маркированные ферменты антител или антигенов. Существуют две модификации иммуноферментного анализа: непрямой и конкурентный. Метод непрямого иммуноферментного анализа основан на связывании специфических к вирусу лейкоза антител с антигеном ВЛКРС, адсорбированным на стенках лунок планшета для микротитрования. Связавшиеся антитела выявляют с помощью видоспецифических антител, меченых ферментом (пероксидазой), с последующим ферментативным превращением бесцветного субстрата пероксидазой в окрашенный продукт. Интенсивность окраски прямо пропорциональна содержанию антител к ВЛКРС в сыворотке крови. В основе конкурентного иммуноферментного анализа лежит способность антител к ВЛКРС, содержащихся в испытуемой сыворотке, блокировать связывание антигена ВЛКРС с антителами к ВЛКРС, иммобилизованными (адсорбированными) на стенках лунок планшетов для микротитрирования (МТП). Антиген ВЛКРС, меченных пероксидазой (конъюгатом антител с пероксидазой), и последующего ферментативного превращения бесцветного субтрата пероксидазы в окрашенный продукт. В том случае, если испытуемый материал не содержал антител к ВКЛРС, интенсивность окрашивания максимальна. Антитела к ВЛКРС в испытуемом материале снижают интенсивность окрашивания прямо пропорционально их содержанию [1].

Известен способ выявления больных лейкозом крупного рогатого скота животных, при котором проводят повторные серологические исследования в РИД испытуемых положительных сывороток крови, и при обнаружении специфических антител к антигенам ВЛКРС в титре 1:8 и выше животное оценивают как больное (патент РФ №2200955, МПК G01N 33/53, 2003 г.) [2].

Недостатком этих методов является не высокая чувствительность и специфичность РИД, в результате чего они не довыявляют инфицированных ВЛКРС животных в стаде.

Метод ИФА обладает рядом значительных преимуществ: более высокая, чем в РИД, чувствительность и специфичность, возможность автоматизации процесса и сокращения времени анализа.

Иммуноферментный анализ широко используют в Национальных программах по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота во многих странах Западной Европы и Америки. Несмотря на то, что для постановки ИФА выпускаются специальные диагностические наборы, применение методов иммуноферментного анализа в диагностике лейкоза крупного рогатого скота в нашей стране не нашло широкого применения.

Одним из недостатков серологических методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота, в том числе и ИФА, является то, что они не позволяют выявлять «связанные антитела». В результате снижается эффективность оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота [1].

Генно-молекулярный метод. ПЦР представляет собой метод, проходящий invitro, при котором происходит экспоненциальное увеличение специфического фрагмента последовательности ДНК. ПЦР позволяет обнаруживать геном как вируса (РНК), так и провирусной ДНК (встроенной в геном клеток хозяина) на самых ранних стадиях инфицирования , еще до появления в организме первых специфических противовирусных антител.

Первые ПЦР исследования, направленные на выявление ВЛКРС – провируса у крупного рогатого скота, провели Н.М. Naifetal в 1990 году. Также метод позволяет выявлять животных с низкими, для выявления серологическими методами, титрами антител и у толерантных животных- такие животные появляются при внутриутробном заражении плода в первый триместр стельности, они являются вирусоносителями и источником болезни, но сами не вырабатывают антител против вируса лейкоза ВЛКРС.

На современном этапе борьбы с лейкозом для диагностики заболевания широко применяются серологический и гематологический методы. В отдельных регионах применяют ПЦР. И только повсеместное использование методов ранней диагностики позволяет избегать встречи с клиническими и патоморфологическими проявлениями данного заболевания, которые еще каких-то 50-60 лет назад можно было увидеть довольно часто. Использование только гематологического метода не позволяет осуществлять оздоровительную работу в стаде, так как он служит исключительно для выявления животных повышенного риска перехода в опухолевую стадию. Поэтому эффективная борьба с лейкозом должна строиться на своевременной серологической и молекулярной диагностике с разделением стада на группы здоровых и инфицированных особей, с постепенной элиминацией последних [1].

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Бобкова Г.Н. Лейкоз крупного рогатого скота / Г.Н. Бобкова, П.П. Шамаро, Т.А. Прудникова // Вестник Брянской ГСХА. 2011 . С. 42–48

2. http://min.usaca.ru/uploads/article/attachment/2148/

3.https://patents.google.com/patent/RU2425377C1/ru

4. http://www.ids55.ru/ss/articles/151-2019-08-26-10-44-05/5166-2019-12-25-09-50-40.html