XIII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2021

Статья посвящена изучению биопленок, так как образование биопленок усложняет диагностику и лечение заболеваний, ведет к хронизации патологических процессов в организме человека. Исследование образования и структуры биопленок, их количественного и качественного состава позволит понять процессы протекания многих опасных заболеваний, вызываемых микроорганизмами. В настоящее время актуален вопрос совершенствования методов изучения биопленок в лабораторных условиях.

Ключевые слова: биопленка, структура биопленки, экология биопленки, методы исследования биопленки, количественная характеристика биопленки, качественная характеристика биопленки.

The article is devoted to the study of biofilms, since the formation of biofilms complicates the diagnosis and treatment of diseases, leads to the chronicization of pathological processes in the human body. The study of the formation and structure of biofilms, their quantitative and qualitative composition will make it possible to understand the processes of many dangerous diseases caused by microorganisms. Currently, the issue of improving methods for studying biofilms in laboratory conditions is relevant.

Keywords:biofilm, biofilm structure, biofilm ecology, biofilm research methods, quantitative characteristics of biofilms, qualitative characteristics of biofilms

Биопленки – это многоклеточные сообщества, которые соединяются вместе внеклеточным матриксом собственного производства и необратимо связаны (не удаляются осторожным промыванием) с поверхностью. Ван Левенгук с помощью своих простых микроскопов впервые обнаружил микроорганизмы на поверхности зубов, и ему можно приписать открытие микробных биопленок.

Подробное исследование биопленок будет ждать электронного микроскопа, который позволяет делать фотомикроскопию с высоким разрешением при гораздо большем увеличении, чем световой микроскоп. Джонс и другие учёные использовали сканирующую и просвечивающую электронную микроскопию для исследования биопленок на капельных фильтрах на очистных сооружениях и показали, что они состоят из различных организмов (на основе морфологии клеток), эти исследователи также смогли показать, что матричный материал, окружающий и заключающий клетки в этих биопленках, был полисахаридом.

Механизмы, которые бактерии используют для образования биопленок, различаются, часто в зависимости от условий окружающей среды и частных характеристик штамма [1].

В природе биопленки широко распространены, они влияют на человека разными способами, так как могут формироваться в естественных, медицинских и промышленных условиях у большинства бактерий. Например, образование биопленок на медицинских устройствах, таких как катетеры или имплантаты, часто приводит к трудно поддающимся лечению хроническим инфекциям. Более того, инфекции были связаны с образованием биопленок на поверхностях человека, таких как зубы, кожа и мочевыводящие пути.Многие патогены, такие как E. coli, Salmonella, Yersinia enterocolitica, Listeria, Campylobacter, существуют в форме биопленки на поверхности пищевых продуктов или на поверхности оборудования для их хранения. Однако биопленки на поверхности человека не всегда вредны. Например, биопленки зубного налета включают десятки видов, и состав сообщества часто определяет наличие или отсутствие заболевания. В зубном налете наблюдается прогрессирование колонизации, и присутствие полезных видов препятствует колонизации вредными организмами.

В основном образование биопленок исследуется в лабораториях. Имеются значительные отличия между биопленками, которые образуются в организме, и теми, что используются в исследованиях: первые почти всегда содержат множество видов микроорганизмов, а в лабораторных условиях системы состоят из одного вида. В организме биопленки образуются практически на любых поверхностях в условиях текучести на границе двух фаз среды из неорганических материй, а в лабораторных условиях они почти всегда растут на поверхности пластика или стекла [2]. Биопленки образуются на твёрдых субстратах, погруженных в жидкость, а также могут создавать плавающие колонии на различных жидких поверхностях.Граница раздела твердое и жидкое вещество между поверхностью и водной средой (например, водой, кровью) обеспечивает идеальную среду для прикрепления и роста микроорганизмов [3].

Учитывая огромные потенциальные преимущества и недостатки, которые могут принести биопленки, важно, чтобы мы понимали, как бактерии процветают в этих сообществах.

Существует множество преимуществ, которые бактериальное сообщество может получить от образования биопленок, так как многочисленные физиологические процессы, происходящие в биопленке, отличаются от процессов чистых культур этих же бактерий. Следовательно, реакция микроорганизмов на изменение условий окружающей среды в биопленке значительно отличается от реакции одного вида в монокультуре. Такая организация сообщества обеспечивает ее физиологическую стабильность и является основой выживания в экологической сфере.

В дополнение к вышесказанному присутствие внеклеточного матрикса защищает составляющие клетки от внешних агрессий (например,фагоциты макроорганизма неспособны поглощать биопленки в отличие от отдельных бактериальных клеток). Внеклеточные матрицы также действуют как диффузионный барьер для малых молекул. В связи с этим в биопленках диффузия питательных веществ, витаминов или кофакторов происходит медленнее, что приводит к бактериальному сообществу, в котором некоторые клетки метаболически неактивны. Более того, на скорость роста бактерий влияет тот факт, что клетки внутри биопленки находятся в ограниченном пространстве.

Сообщество микроорганизмов организует единую генетическую систему в виде плазмид — кольцевых ДНК, несущих поведенческий код для членов биопленки, определяющих их пищевые (трофические), энергетические и другие связи между собой и внешним миром. Последнее получило специальное определение как социальное поведение микроорганизмов — Qvorum sensis (QS) [4]. QS регуляция широко распространена у бактерий различных грамотрицательных и грамположительных таксономических групп, и QS системы участвуют в контроле большого количества клеточных процессов [3]. 

Основная структурная единица биопленки - микроколония. Близость клеток внутри микроколонии (или между микроколониями)  обеспечивает идеальную среду для создания градиентов питательных веществ, обмена генами и определения кворума. Поскольку микроколонии могут состоять из нескольких видов, круговорот различных питательных веществ (например, азота, серы и углерода) посредством окислительно-восстановительных реакций может легко происходить в водных и почвенных биопленках.

Клетки биопленки могут быть рассеяны либо путем отделения дочерних клеток от активно растущих клеток, отделения в результате уровней питательных веществ, либо срезания агрегатов биопленки (непрерывное удаление небольших частей биопленки).

Более подробно изучена отслойка, вызванная физическими силами. Чакрабарти и Бойд подчеркнули важность физических сил в отслоении, заявив, что тремя основными процессами отслоения являются эрозия или срезание (непрерывное удаление небольших частей биопленки), шелушение (быстрое и массивное удаление) и абразия (отслоение из-за столкновение частиц основной жидкости с биопленкой) [5].

Разрушенные или отшелушенные агрегаты биопленки, вероятно, сохранят определенные характеристики биопленки, такие как свойства устойчивости к противомикробным препаратам, тогда как клетки, которые были сброшены, могут быстро вернуться к планктонному фенотипу.

Для исследования биопленок используют количественные и качественные методы [6].

Таблица

Методы исследования биопленок

Количественные методы исследования биопленок		Качественные методы исследования биопленок
Прямые	Косвенные
Определение количества жизнеспособных клеток путем прямого посева материала биопленки на питательную среду	Метод определение сухой массы	Сканирующая электронная микроскопия
Автоматизированный подсчет клеток (метод Коултера и проточная цитометрия)	Методы Брэдфорда, Лоури и метод с использованием бицинхониновой кислоты.)	Сканирующая электрохимической микроскопии
Световая микроскопия	Метод каталитического окисления	Малоугловое рентгеновское рассеяние
Флуоресцентная микроскопия	Анализ интенсивности окрашивания связанным красителем	Поверхностный плазменный резонанс
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопии (CLSM)	АТФ биолюминесценция	Электрохимический поверхностный плазменный резонанс
Атомно-силовая микроскопия	Микровесы на кристаллах кварца (кварцевые микровесы)

Методы количественной оценки включают в себя множество различных способов изучения биопленок.

Определение количества жизнеспособных клеток происходит путем посевана агаровые пластинки и подсчета выросших колоний. Данный метод позволяет разделить клетки на чашке с агаром и выращивать колонии из клеток, таким образом, дифференцируя живые клетки от мертвых и количественно определяя живые.

Методы автоматизированного подсчета клеток в культурах микроорганизмов на жидких средах – это метод Коултера и проточная цитометрия. Метод Коултера включает в себя пропускание заряженных клеток микроорганизмов в растворе электролита через отверстие, являющееся частью электрической цепи. При этом клетки изменяют сопротивление цепи и регистрируются на основании изменений напряжения. Изменения напряжения соответствуют размерам клеток. Однако этот метод не позволяет отделять живые клетки от мертвых.

Метод проточной цитометрии использует систему гидрофокусировки, которая обеспечивает одиночное прохождение клеток в потоке. Индикация микроорганизмов основывается на рассеивании лазерного луча при прохождении через него клеток микроорганзмов. Основными преимуществами проточной цитометрии являются скорость, простота и точность измерений. Метод проточной цитометрии дает возможность определения размеров клеток, свойств их поверхности, метаболической активности и позволяет произвести дифференцировку клеток с использованием дополнительного окрашивания или эндогенных флуоресцентных меток.

Световая микроскопия объективизирует анализ компонентов образующейся биопленки. После окрашивания выявляется спектр структур и их тинкториальные свойства.

Флуоресцентная микроскопия также используется в лабораториях для подсчета клеток на незрелых биопленках in situ или после гомогенизации. После приобретения биопленкой трехмерной структуры требуется ее гомогенизация с последующим подсчетом взвеси микроорганизмов в камере Петрова-Хауссера.

Преимуществами методов световой и флуоресцентной микроскопии является возможность использования различных метаболических или избирательно проникающих красителей, позволяющих отличить живые клетки от мертвых [6].

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопии (CLSM) позволяет получать четкие 3D-изображения биопленок с высоким разрешением. Кроме того, возможно использование одного или нескольких лазеров возбуждения для последовательного или одновременного просмотра нескольких флуоресцентных маркеров, включающихся в биологические соединения, или флуоресцентных белков и генетического материала, экспрессирующихся модифицированными микроорганизмами. CLSM позволяет реконструировать клеточную линию, измерить локальные скорости роста и идентифицировать все клетки в поле зрения, которые не связаны с исходной клеткой – основателем биопленки.

Атомно-силовая микроскопия применяется для получения изображений биологических объектов с высоким разрешением в диапазоне от нанометра до микрометра. С помощью атомно-силовой микроскопии можно количественно оценить силы адгезии между живыми клетками, поверхностью и даже отдельными молекулами, а также показать консистенцию биопленочных структур с разнообразным распределением клеток, внеклеточного матрикса и заполненных водой каналов и пор.

Определение сухой массы начинают с помещения субстрата с биопленкой в печь при постоянной температуре до тех пор. Необходимо удаление всей воды и достижение постоянного веса. Разница в весе между биомассой на субстрате и субстратом без биомассы и есть сухая биомасса.

Методы Брэдфорда, Лоури и методы с использованием бицинхониновой кислоты определяют количество общего белка.

Метод Бредфорда оценивает комплекс красителя (кислотного синего 90) с белком посредством адсорбционной фотометрии. При взаимодействии аминокислот и красителя происходит смещение спектра поглощения от более низких показателей до 595 нм. Количество белка оценивают с помощью калибровочных кривых.

Метод Лоури предполагает исследование оптической плотности окрашенных продуктов, которые образуются при взаимодействии белков с солями меди в присутствии реактива Фолина при длине волны 750 нм.

Метод с использованием бицинхониновой кислоты аналогичен методу Лоури и основан также на восстановлении ионов меди при взаимодействии с рядом аминокислот (цистеином, цистином, триптофаном, тирозином). Но в данном случае оптические плотности измеряют при длине волны 562 нм.

Метод каталитического окисления при температуре, достигающей 680° C показывает количество общего органического углерода, разницу между значениями общего углерода и неорганического углерода.

Анализ интенсивности окрашивания связанным красителем биопленки, которая выращивается с использованием микротитровальных планшетов, позволяет оценить выраженность биопленкообразования бактерий. Применяемая при фотометрии длина волны составляет 530–600 нм.

АТФ биолюминесценция применяется для оценки жизнеспособности клеток биопленки. Излучение фотона молекулой АТФ при биолюминесценции детектируется на длине волны 550–570 нм.

Микровесы на кристаллах кварца (кварцевые микровесы) позволяют проводить измерение накопления биопленки во времени. Прибор состоит из небольшого диска монокристаллического кварца, который приводится в движение посредством приложенной разности колеблющихся потенциалов. Для образования биопленки на поверхности диска его помещают в проточный канал биореактора. Изменение массы биопленки пропорционально сдвигу резонансной частоты, это позволяет измерять накопление биопленки по мере формирования.

Методы качественной оценки биопленок включают визуализацию поверхности биопленки, ее пространственную организацию, морфологическую оценку компонентов, взаимодействие с окружающей средой [6].

Сканирующая электронная микроскопия обычно используется для получения изображения рельефа поверхности с высоким разрешением, позволяющим оценить бактериальные взаимодействия внутри биопленки, организацию полисахаридного матрикса и морфологию биопленки, помогает изучить динамику ее формирования и деструкции. Общее увеличение может достигать 500 000 крат.

Сканирующая электрохимической микроскопии позволяет оценить топологическую структуру и химические свойства поверхностей изучаемой биопленки, демонстрирует трехмерную модель биопленок.

Малоугловое рентгеновское рассеяние может быть использовано для изучения компонентов экзополисахаридного матрикса, структуры и молекулярного взаимодействия.

Поверхностный плазмонный резонанс и электрохимический поверхностный плазмонный резонанс используют для изучения физиологии бактерий и их электрохимической активности в режиме реального времени.

Таким образом, при наличии огромного спектра возможностей и методов, доступных к использованию при изучении микробных сообществ, их исследование и сегодня является актуальной и перспективной задачей для микробиолога – исследователя.

Список литературы:

1. Николаев Ю.А., Плакунов В.К., Биопленка — «город микробов» или аналог многоклеточного организма? Микробиология. 76(2). 2007. 163 с. 

2. Ерощенко Д.В. Влияние факторов внешней среды на первый этапы образования биопленок бактериями Staphylococcus epidermidis: автореф. дис. 03.02.03. докт. биол. наук. Пермь, 2015. 137 с.

3. Гостев В.В., Сидоренко С.В. Бактериальные биопленки и инфекции // Журнал инфектологии. 2010. Том 2. № 3. 

4. Мальцев С.В., Мансурова Г.Ш. Что такое биопленка? // Практическая медицина. 2011. [Электронный ресурс] URL: http://pmarchive.ru/chto-takoe-bioplenka/  (дата обращения: 20.11.2020)

5.  Boyd A., Chakrabarty A.M. Role of alginate lyase in cell detachment of Pseudomonas aeruginosa. Appl Environ Microbiol. 1994. Vol. 60(7). 2355–2359.

6. Галимзянов, Х. М., Башкина О.А., Досмуханова Э.Г., Абдрахманова Р.О., Демина Ю.З., Даудова А.Д., Алешкин А.В., Несвижский Ю.В., Рыбкин В.С., Афанасьев С.С., Сентюрова Л.Г., Карнаух М.М., Аршба И.М., Рубальский М.О., Стемпковская Н.И., Кужина И.О., Рубальский Е.О. Методы исследования биопленок // Астраханский государственный медицинский университет. 2019. Том 14. №3. С 8-20.

Код для цитирования: Скопировать