XII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2020

Актуальность исследования. В настоящее время ВИЧ и СПИД – это важнейшая медико-социальная проблема, т. к. число заболевших и инфицированных  продолжает расти  во всем мире, охватывая людей, которые не входят в группы риска. Распространение ВИЧ/СПИДа стало одной из серьезнейших проблем 21 века.

К сожалению,  до сих пор существует мнение, что ВИЧ-инфекцией заражаются только антисоциальные, наркотизированные люди. И хотя действительно парентеральный путь заражения остается ведущим, в последнее время растет половой путь передачи, вовлекая в инфекционный процесс лиц из других групп населения, не связанных с употреблением наркотиков. Остановить ВИЧ можно только в случае значительного усиления профилактических мероприятий, повышения уровня знаний среди населения (особенно среди его молодой части) о путях заражения ВИЧ и мерах безопасного поведения. Всемирный день борьбы со СПИДом стал ежегодным событием в большинстве стран. Хотя 1 декабря определена как дата для проведения Дня, во многих сообществах организуется ряд мероприятий, проводимых в течение недель и дней до и после официального празднования.

По состоянию на 30 июня 2019 г. кумулятивное количество зарегистрированных случаев выявления ВИЧ-инфекции среди граждан Российской Федерации составило 1 376 907 человек (по предварительным данным). К концу первого полугодия 2019 г. в стране проживало 1 041 040 россиян с диагнозом ВИЧ-инфекция, исключая 335 867 умерших больных. (Федеральный научно-методический центр по профилактике и борьбе со СПИДом ФБУН Центрального НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора.)

На данный момент любая исследовательская и профилактическая работа по темам ВИЧ и СПИД (а также коинфекциям: гепатиты, туберкулез) является актуальной. Особенно важно, как и при любой болезни, понимать не только ее происхождение, пути передачи, но и методы лечения – именно о них и пойдет речь.

Механизм заражения – его исследование и результаты

Для начала стоит осветить сам механизм заражения. Размер генома ВИЧ более чем в 100 тысяч раз меньше человеческого, однако, вирус способен воспользоваться белками, которые не способен воспроизводить сам, чтобы размножаться и заражать новые клетки. Ученые решили выяснить, как ему это удается, и сфокусировали свое внимание на двух важных вирусных белках: Env и Vif. Белок Env располагается на внешней оболочке вируса. Его задача — связаться с рецепторами на поверхности клетки-хозяина и помочь мембране, окружающей вирус, слиться с клеточной мембраной. Второй белок, Vif, берет на себя функцию противостояния защитным системам клетки, разрушая ферменты, которые та производит, чтобы защитить себя от инфекции.

Для этого исследователи внедрили в геном ВИЧ специальные молекулярные липучки, которые позволяют вирусному белку сцепиться с тем белком клетки, с которым он должен взаимодействовать, чтобы обеспечить успешный захват. Такой белок, выдернутый из массы других соединений клетки, проще выявить с помощью обычных методов молекулярного анализа. С другой стороны, необходимо множество различных липучек, чтобы как можно более полно выявить сеть различных соединений, помогающих вирусу перестроить клетку.

После этого модифицированным ВИЧ позволили заразить культуру человеческих клеток. Таким образом, ученым удалось выявить большое количество клеточных белков, участвующих в заражении. Один из белков, как оказалось, помогает вирусу выстраивать молекулярные мосты, чтобы эффективнее заражать все новые и новые клетки, не выходя наружу.

Основная мишень для вируса иммунодефицита человека — это Т-лимфоциты, которые отвечают за иммунитет. Вирус проникает внутрь этих клеток, связываясь с рецептором CD4. Далее c его генетического аппарата, представленного РНК, копируется молекула ДНК. После заражения ВИЧ Т-лимфоциты перестают поддерживать иммунитет в организме человека и становятся фабриками по производству все новых и новых копий вируса. При поражении иммунной системы даже самая незначительная простуда способна привести к тяжелым последствиям. Именно поэтому ВИЧ так опасен.

Лечение

На сегодняшний день существует единственный метод лечения ВИЧ, который может остановить развитие ВИЧ-инфекции и предотвратить стадию СПИДа - это антиретровирусная терапия (АРВТ).

АРТ не излечивает ВИЧ-инфекцию, но подавляет репликацию вируса в организме человека и содействует укреплению его иммунной системы и восстановлению ее способности бороться с инфекциями. Кроме того, каждый третий человек с ВИЧ обращается за помощью на поздних стадиях болезни с низким числом CD4 и высоким риском серьезного заболевания и смерти. Для уменьшения этого риска ВОЗ рекомендует предоставлять таким пациентам «пакет помощи», включающий помимо АРТ тестирование и лечение наиболее часто возникающих серьезных и чреватых смертельным исходом инфекций, таких как туберкулез и криптококковый менингит.

В 2016 году ВОЗ выпустила второе издание Сводного руководства по использованию антиретровирусных препаратов для лечения и профилактики ВИЧ-инфекции. В этом руководстве рекомендуется обеспечивать пожизненной АРТ всех людей с ВИЧ, включая детей, подростков и взрослых, беременных и кормящих женщин независимо от клинического статуса или числа клеток CD4. К середине 2019 г. эту рекомендацию приняли 182 страны, в которых проживает 99% всех людей с ВИЧ в мире.

В руководство 2016 г. включены новые альтернативные варианты АРВ, отличающиеся большей переносимостью и эффективностью и меньшей частотой прерывания лечения по сравнению с используемыми в настоящее время лекарственными средствами: долутегравир + низкодозовый эфавиренз в качестве терапии первого ряда и ралтегавир + дарунавир/ритонавир в качестве терапии второго ряда.

В 2018 г. АРТ получали 23,3 миллиона носителей ВИЧ во всем мире. В 2018 г. был достигнут показатель глобального охвата АРТ на уровне 62% носителей ВИЧ. Однако требуются еще большие усилия для расширения масштабов лечения, особенно детей и подростков. По состоянию на конец 2018 г. только 54% из них получали АРТ, и ВОЗ оказывает поддержку странам для ускорения работы по обеспечению своевременной диагностики и лечения больных из числа этих уязвимых групп населения. Расширение доступа к лечению является одной из центральных задач, выдвинутых на 2020 г., с тем чтобы вернуться к запланированным темпам ликвидации эпидемии СПИДа к 2030 году.

Рекомендуемое ВОЗ в настоящее время лечение является комбинацией из трех антиретровирусных препаратов — тенофовира, ламивудина (или эмтрицитабина) и эфавиренза — в форме одной таблетки, принимаемой один раз в день.

Альтернативы в будущем

История борьбы с вирусом иммунодефицита человека посредством белка рекомбиназы началась в 2007 году. С тех пор прошло более десять лет, и тот же коллектив исследователей опубликовал новую работу, в которой описаны успехи, достигнутые ими за это время. В 2007 году ученые модифицировали Cre-рекомбиназу, заставив ее распознавать концевые повторы последовательности ВИЧ и удалять их из генома человека. Но тогда речь шла всего лишь об одной последовательности, в то время как существует множество модификаций вируса иммунодефицита, имеющих разные концевые повторы. Поэтому задача, стоящая перед авторами новой работы, заключалась в поиске такой последовательности длинных концевых повторов, которая бы максимально совпадала со всеми известными вариантами вирусной ДНК.

Для поиска такой консервативной последовательности они анализировали базу данных с геномами ВИЧ. Эта база данных, созданная при участии Лос-Аламосской национальной лаборатории (США), — крупнейшее в мире хранилище всех известных на сегодняшний день генетических данных о вирусе иммунодефицита человека. Информация хранится в виде непрерывных строчек из четырех букв, которые обозначают нуклеотиды ДНК. В отличие от подавляющего большинства организмов, ДНК для ВИЧ — это не «родная» генетическая молекула, а «перекодированный» вариант его собственной РНК.

Молекула ДНК, полученная на базе РНК, называется обратным транскриптом. Анализ всех концевых повторов из этой библиотеки позволил выявить наиболее подходящую последовательность, на 90% схожую с большинством подтипов вируса иммунодефицита. Следующий этап работы заключался в создании рекомбиназы, способной распознавать такую последовательность и вырезать ее из генома. Для этого ученые применили уже хорошо зарекомендовавший себя метод молекулярной эволюции (чаще используется термин «метод направленной эволюции белковых молекул»).

Как правило, эволюционные процессы происходят без активного участия человека и длятся многие сотни лет. В ходе таких процессов наступает адаптация признаков в ответ на изменяющиеся условия. В XXI веке человечеству удалось «приручить» эволюцию, запуская ее в пробирке. Став одним из лабораторных методов, молекулярная эволюция, в частности, позволяет производить отбор белковых молекул с заданными свойствами. В ходе этой работы из множества мутантных белков рекомбиназ со случайно измененными аминокислотами был отобран один-единственный, способный узнавать вычисленную универсальную последовательность для всех известных ВИЧ.

Для начала «отбора» берутся генетические конструкции, нарабатывающие мутантные Cre-рекомбиназы, и смешиваются с ДНК, из которой им предстоит вырезать последовательность-мишень. Если рекомбиназа узнала мишень, то она вырезает ее. В результате ДНК теряет особый маркерный участок, который называется сайтом рестрикции (разрезания). При добавлении к ДНК фермента, который распознает этот сайт, молекула ДНК разделяется поперек на два фрагмента, и исследователи, поместив ДНК в специальный гель с красителем, видимом в ультрафиолетовом спектре, могут наблюдать две полоски вместо одной. В случае, когда рекомбиназа срабатывает верно, такого сайта нет, и при добавлении фермента ДНК не распадается на части. Именно по наличию одного фрагмента ДНК вместо двух и отбирали лучшие из лучших рекомбиназ. Отбор проходил в несколько этапов, пока наконец «правильная» рекомбиназа не была найдена.

Далее необходимо было проверить эффективность такой рекомбиназы при столкновении с реальной угрозой — вирусом инфицированного человека. Поэтому полученный фермент транспортировали в инфицированные иммунные клетки, взятые у пациента. После обработки рекомбиназой определили последовательность ДНК в клетках больного. Вирусных генов найдено не было. Поэтому эксперимент был признан удачным. Но, как и десять лет назад, говорить о том, что ВИЧ полностью побежден, еще рано. Теперь основная проблема в такой системе лечения — придумать способ адресной доставки фермента рекомбиназы в пораженные клетки организма.

Некоторое время назад группа ученых из немецкого Института экспериментальной вирусологии и иммунологии уже пыталась использовать инструмент редактирования геномов для удаления ВИЧ из культуры HeLa. Они модифицировали Cre-рекомбиназу методом направленной эволюции и один из полученных вариантов использовали для удаления вируса путем контролируемой рекомбинации. Однако надо учитывать, что между Т-хелперами и опухолевой HeLa есть немало различий, к тому же, авторы не предлагают вариантов доставки или экспрессии гена Tre-рекомбиназы (усовершенствованный вариант фермента Cre).

С другой стороны, группа американских исследователей опубликовала в марте 2016 года статью, где подробно описывались метод доставки и механизм удаления вируса. Ученые ставили перед собой задачу не только полностью избавить клеточную культуру Т-хелперов от вируса, но и проверить отсутствие цитотоксического действия самой CRISPR/Cas9 системы. Единственный недостаток этого геномного инструмента в том, что из-за сравнительно небольшой длины спейсера, даже при наличии страхующего элемента PAM, в больших геномах могут быть найдены нецелевые сайты, подверженные разрезанию (off-target sites). Именно поэтому исследователи уделяли данной проблеме немало внимания.

Работа проводилась с использованием штамма ВИЧ-1 и клеточной линии Т-хелперов 2D10, зараженной вирусом в покоящейся стадии. Доставка и экспрессия sgРНК/Cas9 осуществлялась с помощью лентивирусного вектора.

Известно, что для встраивания кДНК ВИЧ в хромосомы необходимы длинные концевые повторы (Long Terminal Repeat, LTR) — краевые последовательности нуклеотидов, повторенные сотни или тысячи раз. Такие повторы присутствуют у обеих молекул РНК ВИЧ, и если «нацелить» Cas9 на них, то удастся создать разрыв и вырезать вирус. Но группа под руководством Рафаля Камински создала не просто sgРНК к LTR. Ученые учли быструю скорость мутационного процесса вирусов и поместили в sgРНК наиболее консервативную область LTR, присутствующую у всех изолятов вируса.

Для оценки того, вырезался ли вирус из двух мест встраивания (1-я и 16-я хромосомы), было проведено полногеномное секвенирование. Оно показало, что в клетках, где экспрессировались и гены Cas9, и sgРНК, провирусная ДНК отсутствует. Был проведен анализ того, могут ли гены, куда встроился провирус (RSBN1 и MSRB1), и близлежащие гены нормально транскрибироваться после его вырезания. Ученые показали, что как RSBN1, так и MSRB1 нормально экспрессируются. Соседние гены также не претерпели изменений.

Таким образом, можно с уверенностью сказать, что группа Камински впервые успешно удалила ВИЧ из культуры зараженных Т-хелперов. Данное достижение приблизило человечество к победе на ВИЧ. Да, это только культура клеток. Да, до внедрения данной техники в медицину пройдут годы, а может и десятки лет, но данная работа является уникальной в своем роде, ибо ученые не только бросили вызов одному из страшнейших заболеваний на планете, но и смогли победить его — пусть даже масштаб сражения пока невелик.

Перспективы применения данной технологии очевидны: введя пациенту вектор, содержащий гены Cas9 и sgРНК, мы добьемся их экспрессии и полного удаления вируса из клеток. Современная терапия, направленная против ретровирусов, являющаяся основным средством борьбы с ВИЧ, не удаляет вирус из клеток, так как провирус остается встроенным в ДНК хозяина. В свою очередь, данный подход не оставляет вирусу шансов укрыться.

Выводы

62% взрослых и 54% детей с ВИЧ-инфекцией во всем мире получали антиретровирусную терапию (АРТ) в 2018 г.

По новым рекомендациям ВОЗ, антиретровирусную терапию необходимо предоставлять, независимо от количества клеток CD4, всем детям с ВИЧ в возрасте до пяти лет, всем беременным и кормящим женщинам с ВИЧ и всем ВИЧ-позитивным партнерам в парах, где другой партнер не инфицирован. Организация по-прежнему рекомендует предоставлять антиретровирусную терапию всем людям с ВИЧ, имеющим активный туберкулез или гепатит В.

Еще одной новой рекомендацией является предложение всем взрослым людям, начинающим АРТ, одинаковой для всех одной ежедневной комбинированной таблетки с фиксированной дозой. Такие комбинированные таблетки проще принимать. Они безопаснее по сравнению с ранее рекомендуемыми альтернативными комбинированными препаратами и могут использоваться среди взрослых людей, беременных женщин, подростков и детей старшего возраста.

Охват лечением в первом полугодии 2019 г. в Российской Федерации составил 44,8% от числа живших с диагнозом ВИЧ-инфекция и 64,7% от числа состоявших на диспансерном наблюдении. В первом полугодии 2019 г. вирусная нагрузка была подавлена у 267 177 пациентов, что составило 62,1% от числа 430 375 больных, прошедших обследование по ее определению. За первые 6 месяцев 2019 г. 55 152 инфицированных ВИЧ были впервые взяты на антиретровирусную терапию, 40 360 пациентов были впервые взяты на диспансерное наблюдение.

Современная АРВТ не может уничтожить ВИЧ в организме полностью, но она сохраняет людям с ВИЧ жизнь и здоровье, не давая вирусу вредить иммунной системе. При приеме антиретровирусной терапии вирусная нагрузка становится неопределяемой и остается такой, пока человек принимает лечение. При этом ВИЧ-инфекция оказывается «обезвреженной» и иммунный статус перестает снижаться. К сожалению, если человек прекращает принимать терапию, вирусная нагрузка сразу начинает повышаться. Поэтому АРВТ предназначена для того, чтобы принимать ее постоянно.

Использованные источники:

[1] www.who.int

[2] biomolecula.ru

[3] www.physics.smu.edu

[4] aids43.ru

5. Покровский В.В. (редактор). ВИЧ-инфекция и СПИД: Национальное руководство. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013.

Код для цитирования: Скопировать