XII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2020

Большинство редких врожденных расстройств и синдромов имеют генетическую причину, но уровень диагностики при стандартном обследовании составляет всего около 50%. Методы секвенирования всего экзома улучшили генетическую диагностику заболеваний за последние несколько лет [1].

Аномалии плода выявляются в 2–5% беременностей. В настоящее время стратегии пренатального тестирования включают количественную флуоресцентную полимеразную цепную реакцию и флуоресцентную гибридизацию in situ для быстрого тестирования на анеуплоидию, G-полосный кариотипирование и анализ хромосомных микрочипов (CMA) для обнаружения изменения числа копий. Эти цитогенетические тесты ограничены их разрешением. Количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция демонстрирует трисомию примерно у 30% дисморфных плодов, а кариотипирование выявляет патогенные несбалансированные хромосомные перестройки еще на 5%. CMA обнаруживает дополнительные варианты количества патогенных копий в 3-6,5% структурно аномальных плодов с нормальными кариотипами [2, 3]. Используя эти тесты в комбинации, можно определить генетическую этиологию у 40% плодов с дисморфизмом, но в большинстве случаев диагноз не диагностируется.

Секвенирование целого экзома следующего поколения (WES) обеспечивают гораздо большее разрешение, вплоть до уровня единой пары оснований. Для WGS геном (кодирующие и некодирующие области) секвенируют без предварительного отбора, тогда как для WES, в настоящее время наиболее широко используемого метода для диагностических применений, области ДНК, содержащие экзоны, составляют от 1% до 2%. генома, содержат более 85% всех вызывающих заболевание мутаций, сначала избирательно захватываются перед секвенированием [4].

WES и WGS были успешно применены для очень быстрой неотложной генетической диагностики в педиатрических и неонатальных отделениях интенсивной терапии по сравнению с традиционным пренатальным тестированием [5].

Секвенирование "экзома" — всех экзонов в геноме - включает в себя измельчение генома на миллионы частей, захват и секвенирование только отобранной ДНК из областей экзона. Он отличается от транскриптомного секвенирования тем, что фокусируется на ДНК, а не на экспрессированной РНК в данной клетке [6].

Генетическая изменчивость играет главную роль как при менделирующих, так и при неменделирующих заболеваниях. Среди примерно 2600 менделирующих заболеваний, которые были исследованы, подавляющее большинство вызвано редкими мутациями, которые влияют на функцию отдельных белков; в отдельных локусах приблизительно 85% мутаций, вызывающих заболевания, обычно можно обнаружить в кодирующей области или в установленных местах сплайсинга [7]. Секвенирование полных кодирующих областей геномов (то есть «exome») может сыграть важную роль в обнаружении генов заболевания, а также в клиническом использовании для установления генетического диагноза. Поскольку кодирующие области составляют только приблизительно 1% генома человека, это потенциально эффективная стратегия для идентификации редких функциональных мутаций, тем более что способность интерпретировать функциональные последствия вариации последовательности вне кодирующих областей сильно ограничена. Полезность этого подхода была продемонстрирована при раке, в котором амплификация отдельных экзонов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) привела к выявлению новых соматических мутаций с большим эффектом [8].

Появление технологии секвенирования следующего поколения (NGS) привело к значительному увеличению числа генетических диагностических тестов, доступных для лечащего врача. Секвенирование цельного экзома (WES) стало доступно в качестве диагностического теста, выполняемого в клинических лабораториях [9].

Технический рабочий процесс для WES обычно включает в себя начальную подготовку библиотеки перекрывающихся фрагментов NGS из геномной ДНК. Библиотека фрагментов затем гибридизуется в растворе с олигонуклеотидными захватными зондами, и захваченные фрагменты дополнительно очищаются и амплифицируются с помощью ограниченных циклов полимеразной цепной реакции. Полученная обогащенная библиотека количественно оценивается и подвергается секвенированию. Содержание зонда захвата варьируется среди коммерческих наборов реагентов, но фокусируется на кодирующих областях (экзонах) и их проксимальной интронной фланкирующей последовательности, а также может включать в качестве мишеней 5' и 3' непереведенные последовательности областей [10].

Секвенирование всего экзома и WGS генерируют большие файлы данных, анализ которых требует существенной вычислительной инфраструктуры и опыта. Существует множество алгоритмов с открытым исходным кодом и коммерческого программного обеспечения, которые способны обрабатывать файлы данных WES и WGS.

Несмотря на то, что образцы WES обычно секвенируются на более высокую глубину (100X против 30X), считывания сосредоточены только на ~2% генома, поэтому требуется меньше общей последовательности, что приводит к снижению затрат. Это достигается путем обогащения или вытягивания процесса, где ДНК или РНК приманки используются для гибридизации с белок-кодирующей частью генома, изолируя его от некодирующей части. Количество последовательности, необходимой для образца 100x exome, составляет ~5-6Gb, что существенно меньше, чем ~90Gb, необходимое для WGS. Это также приводит к снижению затрат на хранение данных и более быстрому, дешевому и простому анализу данных [11].

Таким образом, основными преимуществами в секвенировании экзома будут экономическая эффективность по сравнению секвенирования целого генома (4-5 Гб секвенирования на экзом по сравнению с ~ 90 Гб на геном человека) и всесторонний охват регионов кодирования, что позволяет исследователям сосредоточить свои ресурсы на генах, которые наиболее вероятно влияют на фенотип. Наконец, учитывая быстрый темп открытия новых ассоциаций генетических заболеваний, периодический повторный анализ данных WES/WGS может привести к установлению диагноза, который ранее был недостижим [12].

Используемые источники:

1. http://ugeskriftet.dk/videnskab/diagnostisk-exomsekventering-til-udredning-af-syndromer

2. Wapner RJ, Martin CL, Levy B, et al. Chromosomal microarray versus karyotyping for prenatal diagnosis. N Engl J Med. 2012;367:2175–84.

3. Callaway J. L. A. et al. The clinical utility of microarray technologies applied to prenatal cytogenetics in the presence of a normal conventional karyotype: a review of the literature //Prenatal diagnosis. – 2013. – Т. 33. – №. 12. – С. 1119-1123.

4. Yang Y. et al. Clinical whole-exome sequencing for the diagnosis of mendelian disorders //New England Journal of Medicine. – 2013. – Т. 369. – №. 16. – С. 1502-1511.

5. Willig L. K. et al. Whole-genome sequencing for identification of Mendelian disorders in critically ill infants: a retrospective analysis of diagnostic and clinical findings //The Lancet Respiratory Medicine. – 2015. – Т. 3. – №. 5. – С. 377-387.

6. https://www.nature.com/news/2009/090512/full/459146b.html

7. Antonarakis S. E., Krawczak M., Cooper D. N. The nature and mechanisms of human gene mutation. – 2001.

8. Parsons D. W. et al. An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme //Science. – 2008. – Т. 321. – №. 5897. – С. 1807-1812.

9. https://www.archivesofpathology.org/doi/10.5858/arpa.2016-0622-RA?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%3dpubmed)

10. https://allseq.com/knowledge-bank/1000-genome/wgs-vs-wes/)

11. https://www.illumina.com/techniques/sequencing/dna-sequencing/targeted-resequencing/exome-sequencing.html