XII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2020

Проблемы безопасности взаимодействия организма с химическими агентами окружающей среды возрастает с расширением числа используемых химических соединений, в том числе с внедрением в клиническую практику новых лекарственных средств. Процесс метаболизма лекарственных средств протекает под действием ферментов печени, которые находятся на поверхности эндоплазматического ретикулума клеток гепатоцитов. Главными ферментами печени являются цитохромы Р450, содержащие в своем составе гем и участки связывания с кислородом и субстратом (ксенобиотиком) [1]. Действие цитохрома Р450 может быть направлено либо на обезвреживание, либо на активацию ксенобиотиков [4].

Активность ферментов определяет протекание процесса обезвреживания токсичных соединений и их метаболитов. Цитохром Р450 (CYP) играет важную роль в фазе I биотрансформации ксенобиотиков. Несмотря не всё изобилие изоферментов, лишь несколько из них делают основной вклад в метаболизм ксенобиотиков; это изоферменты CYP1A2, CYP2E1, CYP3A4, CYP2C9, CYP2C19 и CYP2D6. В частности, CYP3A метаболизирует большинство известных лекарственных веществ – от 30% до 40%. У каждого из изоферментов CYP своя функция в метаболических процессах и свой специфический субстрат.

У человека подсемейство цитохромов Р450 3А включает четыре фермента: CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43, содержание которых превалирует в печени, кроме CYP3A43, который в большей степени представлен в предстательной железе. Также подсемейство CYP3A4 участвует в блокаде медленных кальциевых каналов, макролидных антибиотикв, ингибиторовании ГМГ-КоА-редуктазы, катализирует реакцию 6-β-гидроксилирования эндогенных стероидов, в том числе тестостерона, прогестерона, кортизола. Маркерными субстратами для определения активности CYP3A4 являются эритромицин, нифедипин, лидокаин, кортизол [2, 7].  CYP3A4 катализируюет реакции окисления, сульфатирования, N-дезалкилирования и О-дезалкилирования. Барбитураты и антиконвульсанты (карбамазепин, окскарбазепин, фенитоин) являются индукторами CYP 3A4 [5, 6] Ферменты подсемейства имеют перекрывающуюся субстратную специфичность, что затрудняет оценку их индивидуального вклада в метаболизм ксенобиотиков [3]. Это свойство позволяет определять активность ферментов CYP3A неинвазивным способом: по эндогенным кортизолу и его 6β-гидроксилированному метаболиту, отношение концентраций которых является признанным биомаркером активности CYP3A.

Цель исследования: изучить возможность использования метаболического отношения 4β-гидроксихолестерол/холестерол в плазме крови крыс для оценки активности изоферментов подсемейства CYP3A на фоне введения модельных препаратов-индукторов и разработки на основе полученных данных in vivo модели доклинического изучения особенностей метаболизма лекарственных средств.

Задачи исследования:

Провести литературный поиск и анализ статей, посвященных методам определения эндогенных маркёров активности изоферментов подсемейства CYP3A и прогностической значимости результатов проводимого с их помощью фенотипирования данных систем биотрансформации ксенобиотиков.

Оптимизировать методику хромато-масс-спектрометрического количественного определения холестерола и его метаболита 4β-гидроксихолестерола.

Определить фоновый уровень эндогенного синтеза холестерола и его метаболита у животных в исследуемых группах крыс.

Оценить уровень изменения активности метаболического отношения 4β-гидроксихолестерол/холестерол в плазме крыс на фоне на вводе введения лекарственных препаратов-индукторов – преднизолона и карбамазепина.

Дизайн исследования: Настоящее исследование будет включать два ключевых этапа: аналитический и экспериментальный. Аналитический этап исследования состоит в разработке и валидации метода количественного хромато-масс-спектрометрического холестерола и его метаболита 4β-гидроксихолестерола в плазме крови крыс. Для проведения валидации разработанной методики международным требованиям будут учитываться такие параметры как: специфичность, точность, чувствительность, надежность, диапазон линейности отклика, правильность, стабильность. В ходе экспериментального этапа исследования, включённые в исследования крысы будут разделены на три группы – контрольную (n=12) и две экспериментальная группы (n=24). Забор образцов биоматериала будет производиться у всех животных до начала исследования для определения базального уровня холестерола и его метаболита. На протяжении 10 дней животным в экспериментальных группах будет вводиться лекарственные вещества-индукторы в скорректированной терапевтической дозе. Забор образцов крови для определения уровня холестерола и его метаболита будет производиться путём пункции хвостовой вены крысы во временные интервалы в соответствии со утверждённым протоколом исследования. По завершении исследования метаболическое отношение 4β-гидроксихолестерол/холестерол будет определено повторно у животных во всех группах. На основании анализа полученных лабораторных маркёров сделан вывод относительно возможности использования метаболического отношения 4β-гидроксихолестерол/холестерол для оценки степени индукции изоферментов подсемейства СYP3A.

Предполагаемые пути решения задач. Подготовка протоколов аналитического и экспериментального этапа исследования, количественный анализ холестерола и его метаболита в получаемых биологических образцах, а также обработка данных будет проведены на базе кафедре фундаментальной медицины и биологии ВолгГМУ. К основному оборудование, задействованному в ходе аналитического этапа исследования, будет относиться жидкостная хроматографическая система высокого давления Аgilent 1260 c термостатируемым автосемплером и гибридная масс-спектрометрическая система Sciex QTRAP 5500 на базе тандемного масс-анализатора типа тройной квадруполь. Экспериментальный этап исследования будет проведен на базе вивария лаборатории психофармакологии НЦИЛС ВолгГМУ. Обработка данных и статистический анализ будет произведен с использованием программы GraphPad Prism 5.0.

Список литературы:

1. Богуш Т. А Снижение токсичности и повышение эффективности противоопухолевой химиотерапии путем коррекции активности монооксигеназ печени: от эксперимента – в клинику / Т. А. Богуш, Е. А. Богуш, Л. А. Дурнов, А. Б. Сыркин // Вестн. РАМН. – 2002. – № 1. –С. 37–42.

2. В.Г. Кукес. Метаболизм лекарственных средств: клинико-фармакологические аспекты. – М.: Реафарм, 2004. 144 с.

3. Williams et al., 2002

4. С.Б. Середин. Лекции по фармакогенетике. – М.: МИА, 2004. 303 с.

5. Сычев Д. А., Аникин Г. С., Александрова Е. К., Шадрина М. В., Смирнов В. В., Раменская Г. В., Кукес В. Г. Фармакокинетическое взаимодействие лекарственных средств с фруктовыми соками: клиническое значение / Кафедра клинической фармакологии ММА им. И.М. Сеченова, Москва.

6. Фармакология поведения: Хрестоматия / под ред. А.Ю. Беспалова, Э.Э. Завртау, П. Бридсли, Дж. Катца. – СПб.: Изд-во СПбГМУ, 2013. – 466 с.

7. Handbook of drug metabolism. 2nd ed. / Ed. by P.G.  Pearson and L.C. Wienkers – Florida: CRC Press, 2008. 675 p. 7. D.F.V. Lewis, M. Dickins, P.J. Eddershaw, M.H. Tarbit, P.S. Goldfard. Cytochrome P450 Substrate Specifities, Substrate structural Templates and Enzyme Active Site Geometries // Drug metabolism and drug interctions. 1999. V. 15. P. 151.