XII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2020

Способность производить потомство желаемого пола важна для животноводства. Для этого было разработано несколько подходов для определения пола эмбрионов до их переноса у млекопитающих. Методы основанные на эмбрио-биопсии [5] и полимеразной цепной реакции (ПЦР) генов, связанных с половой хромосомой обычно трудоемки и подвержены ошибкам и могут даже повредить нормальное эмбриональное развитие [2; 8].

Неинвазивный генетический маркер позволяет проводить предварительный отбор пола потомства [3].

Поскольку Y-хромосома определяет мужской пол, только мужское потомство может наследовать генетические маркеры, связанные с Y-хромосомой. X-хромосома не совсем подходит, так как она есть у мужского и женского пола. Повсеместно экспрессируемый репортерный ген, связанный с половой хромосомой, можно использовать для указания на наличие Х или Y хромосомы в эмбрионе мыши. Следовательно, экспрессия этого репортерного гена будет отражать пол потомства. В конечном счете, Y-связанная трансгенная линия мыши может более стабильно передавать генетический маркер однополому потомству, а наличие меченого маркера в Y-хромосоме позволяет визуально определять пол эмбрионов и животных [6].

Сайт-специфическая интеграция экзогенных генов может быть легко достигнута с использованием CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, короткие палиндромные кластерные повторы)/Cas9. Бактериальная система типа II CRISPR/Cas9 недавно была превращена в эффективный инструмент редактирования генома состоящий из нуклеазы Cas9 и одной направляющей РНК (single guide RNA, sgRNA). Система CRISPR/Cas9 вызывает двухцепочечный разрыв (DSB) в определенном локусе гена для инактивации генов и используется во многих организмах. Точное редактирование генов может быть достигнуто с помощью механизма гомологичной направленной репарации (HDR), когда предоставляется матрица донорской ДНК [7].

Основываясь на подходе, описанном выше, можно сказать, что использование линии мыши XY^eGFP может помочь различать мужской и женский пол. Повсеместная экспрессия усиленного зеленого флуоресцентного белка у самцов может быть напрямую связана с полом и подходит для обычной идентификации пола эмбрионов у млекопитающих.

Способность производить потомство желаемого пола, является существенной выгодой для производства домашнего скота, и несколько таких методов были разработаны, чтобы определить пол предимплантационных эмбрионов в предыдущих исследованиях. Эти методы включают кариотипирование эмбрионов, флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) на основе ДНК-зонда, специфичного для половой хромосомы, и анализы на основе ПЦР, но эффективность этих методов в отношении пола зависит от размера биопсии эмбриона и может привести к снижению частоты беременности после переноса эмбрионов [4].

Система CRISPR/Cas9 была использована для получения отредактированных генами животных путем микроинъекции мРНК Cas9, sgRNA и донорной матрицы в цитоплазму зигот, что значительно сокращает время, необходимое для получения трансгенных животных.

CRISPR обеспечивает интеграцию гена eGFP в заранее определенный сайт в межгенной области генов Ddx3y и Uty в Y-хромосоме. Локус интеграции находится приблизительно в 5,5 т.п.н. от гена Uty и в 9,3 т.п.н. от гена Ddx3y [9]. Все мыши-самцы с делециями этих двух генов и их потомство мужского пола были фертильными и имели нормальную репродуктивную способность. Уровни экспрессии мРНК генов Ddx3y и Uty в эмбриональных фибробластах мыши (MEF), полученных от мышей Y-Chr-eGFP и WT (дикого типа), были идентифицированы с помощью количественной полимеразной цепной реакции, и никаких существенных различий не наблюдалось. Этот метод не влияет на развитие XY-эмбрионов in vitro по сравнению с результатами на WT-эмбрионах, и не было никакого изменения соотношения полов, что указывает на то, что данный метод может широко использоваться для выбора пола в сельскохозяйственном производстве.

GFP хорошо работает в определении меченых и немеченых эмбрионов мыши, когда они находятся под контролем сильного промотора CAG, В живых клетках не было выявлено побочных эффектов в результате экспрессии eGFP. Начало экспрессии трансгена в эмбрионах зависит от его конкретного промотора, а экспрессия экзогенного гена может быть обнаружена на стадии морулы. Как показывают результаты эксперимента, Y-сцепленное eGFP может использоваться для визуального определения пола предимплантационных эмбрионов со 100% точностью.

Кратковременное облучение под флуоресцентным микроскопом не наносит ущерба жизнеспособности эмбрионов [1]. Поэтому на ранней стадии бластоцисты зеленые мужские и не зеленые женские эмбрионы были разделены для специфического переноса эмбрионов.

Эти данные, впервые демонстрируют, что измененные Y-хромосомы можно использовать для предимплантационных эмбрионов млекопитающего, полученных системой CRISPR/Cas9 и также это обеспечивает быстрый и неинвазивный подход для определения пола эмбрионов без ущерба для точности, осуществимости и практичности метода.

Список литературы:

1. Fink D. et al. Non-invasive instant genotyping of fluorescently labeled transgenic mice //ALTEX-Alternatives to animal experimentation. – 2015. – Т. 32. – №. 3. – С. 222-227.

2. Fu Q. et al. Cloning the swamp buffalo SRY gene for embryo sexing with multiplex-nested PCR //Theriogenology. – 2007. – Т. 68. – №. 9. – С. 1211-1218.

3. Hadjantonakis A. K. et al. Non-invasive sexing of preimplantation stage mammalian embryos //Nature genetics. – 1998. – Т. 19. – №. 3. – С. 220.

4. Handyside A. H. et al. Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification //The Lancet. – 1989. – Т. 333. – №. 8634. – С. 347-349.

5. Harper J. C. et al. Identification of the sex of human preimplantation embryos in two hours using an improved spreading method and fluorescent in-situ hybridization (FISH) using directly labelled probes //Human Reproduction. – 1994. – Т. 9. – №. 4. – С. 721-724.

6. Page D. C. et al. The sex-determining region of the human Y chromosome encodes a finger protein //cell. – 1987. – Т. 51. – №. 6. – С. 1091-1104.

7. Suzuki K. et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration //Nature. – 2016. – Т. 540. – №. 7631. – С. 144.

8. Zhu H. et al. Study of a simple and rapid PCR sex identification of bovine embryo //Journal of Animal and Veterinary Advances. – 2012. – Т. 11. – №. 11. – С. 1847-1852.

9. Zuo E. et al. One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs //Cell research. – 2017. – Т. 27. – №. 7. – С. 933.