Актуальность. Разработке методов прижизненной и посмертной диагнoстики кровепаразитов у животных посвящены ряд работ. Исторически большинство видов кровепаразитов, в том числе и из рода Theileria, были впервые описаны на основе исследования световой микроскопии после открытия Кохом Theileria parva (Koch, 1898). Обычно это выполнялось на окрашенных краской Гимза мазках крови, однако ограничение световой микроскопии в качестве диагностического инструмента заключалось в том, что обнаружение животных-носителей регулярно оставалось незамеченным, а дифференциация между кровепаразитамиразных видов была сложной, поскольку они морфологически очень схожи (Dschunkowsky Luhs, 1904; Theiler, 1904; Lawrence, 1935, 1979; Uilenberg, 1981) [1,2,3].

Диагноз на тейлериоз ставят на основании изучения эпизоотологических данных, клинических признаков болезни, обнаружения специфических патологоанатомических изменений и исследования мазков-отпечатков из пунктата поверхностных лимфатических узлов, печени, селезенки, окрашенных по Романовскому для обнаружения меронтов. В более поздние сроки исследуют мазки крови с целью выявления эритроцитарных стадий тейлерий. Для ранней диагностики и выявления тейлерионосительства разработаны серологические реакции (РСК, РДСК, РИФ) с антигенами из различных стадий развития тейлерий. Так же диагноз на тейлериоз ставится комплексно, учитывают: эпизоотологические данные: сезон, наличие специфических переносчиков; клинические признаки: односторонний лимфоденит, термометрию, анемию, желтушность и др.; патолого–анатомические изменения: спленмегалию, кровавую мочу в мочевом пузыре, наличие язв в сычуге и др.; проводят различные лабораторные исследования, такие как микроскопия, серологические тесты [4].

Для выяснения степени зараженности кровососущих клещей различными видами пироплазмид, в том числе и тейлериями с давних пор применялась ксенодиагностика, которая проводилась вскрытием клещей по методу А.А.Цапруна и А.А.Маркова, отделением слюнных желез и приготовлением мазков из слюнных желез имагинальных стадий клещей, окрашиванием их по методу Романовского-Гимза и просмотром мазков под иммерсионной системой микроскопа на наличие булавовидных и червеобразных форм пироплазмид [4,5,6,7].

Кроме того, применяли исследование гемолимфы клеща по методу И.В.Абрамова. Гемолимфу получали путем отрезания одной конечности клеща. Выступившую на культе капельку гемолимфы наносили на обезжиренное предметное стекло, делали мазок, высушивали его, фиксировали и красили как при исследовании слюнных желез клещей.

Есть способ, при котором из части яиц, отложенных самками клещей также готовили на обезжиренных предметных стеклах мазки, помещая материал в каплю стерильной сыворотки лошади (овцы) или в каплю физиологического раствора. Материал раздавливали костяным шпателем и распределяли тонким ровным слоем, высушивали, фиксировавали метиловым спиртом и окрашивали по Романовскому-Гимза или по Нохту. Просматривали под иммерсионной системой микроскопа на наличие червеобразных форм пироплазмид величиной до 8-10 мкм. Недостатками указанных методов выявления инвазированности клещей тейлериями является низкая эффективность и высокая трудоемкость.

Цель исследований. Усовершенствование диагностикишироко распространенного на юге Казахстана и экономически значимого кровепаразитарного заболевания тейлериоза крупного рогатого скота.

Результаты. Учитывая важность степени инвазированности клещей кровепаразитами для мониторинга и контроля кровепаразитарных болезней, нами были изысканы более современные методы исследования клещей на инвазированность кровепаразитами, в том числе и тейлериями.

Сначала производили сбор клещей с животных и в природных очагах. Собранных в природных биотопах кровососущих членистоногих доставляли в лабораторию живыми.

Далее готовили гомогенат из клещей с последующей постановкой серологических реакций, с использованием в качестве исследуемого антигена гомогената клеща, получали антитейлериозную сыворотку и с указанными компонентами ставили серологические реакции.

Наиболее удобно растирать отдельные экземпляры клещей в пластмассовых пробирках для микропроб. Клеща переносили пинцетом в пробирку и опускали в жидкий азот на 10 - 15 секунд, гомогенизировали пестиком из нержавеющей стали (стержень диаметром 3 - 4 мм с краями, закругленными по внутренней форме пробирки). В пробирку добавляли 0,2 мл 0,01 М фосфатно-буферного раствора, рН 7,2 - 7,4 с антибиотиками (пенициллина 500 ед./мл и стрептомицина 1000 ед./мл). Пестик после использования прожигается над пламенем горелки, охлаждается в жидком азоте и используется повторно. Применение жидкого азота для глубокого замораживания клещей дает возможность сохранить биологическую активность материала и способствует более тонкому измельчению тканей клеща.

Из приготовленных суспензий брали 0,05 мл для исследования. Для приготовления антигена для исследования суспензии клещей перед исследованием осветляли центрифугированием при 2000 об/мин. в течение 10 минут. Оставшийся материал хранили при -40°C или при -70°C в холодильнике или в жидком азоте для повторного исследования.

На втором этапе получали антитейлерийную сыворотку из крови овец-тейлерионосителей.

Затем получали антиген из тейлерий. Полученную кровь обрабатывали трилоном – Б (2 мг/ см³). Эритроциты отмывали физиологическим раствором (рН 7,0-7,2) при 5000 об., в течение 15 минут, 3-5 кратно, до полного осветления надосадочной жидкости. Один объем отмытых эритроцитов смешивали с пятью объемами стерильной, нейтральной дистиллированной воды. Смесь выдерживали 2 часа при + 4 С, затем фильтровали через стерильный двойной марлевый фильтр и центрифугировали при 7000 об/мин., в течение 30 минут. Полученные осадки соединяли в один флакон с бусами, тщательно встряхивали и отмывали дистиллированной водой при повторном центрифугировании, затем подвергали замораживанию-оттаиванию, и 3-кратному центрифугированию-отмыванию до полного просветления надосадочной жидкости. После последнего центрифугирования осадок собирали во флакон, разводили стерильным физиологическим раствором (рН 7,0 – 7,2), в половинном объеме от количества отмытой паразитарной массы, и в течение 30 минут подвергали обработке ультразвуком при 22 КГц. Полученный дезинтеграт использовали в качестве антигена для иммунизации продуцентов внутримышечно. Часть дезинтеграта центрифугировали при 7000 об/мин, в течение 30 минут, осадок использовали для подкожной иммунизации, надосадочную жидкость – для внутривенной иммунизации. Антиген контролировали на стерильность, используя специальные питательные среды (отсутствие бактериального загрязнения и грибковой микрофлоры указывает на чистоту препарата). Активность антигена проверяли титрацией в РДСК, РНГА и ИФА.

Для получения антитейлерийной сыворотки иммунизировали кроликов тейлерийным антигеном. Забор крови начинали с 3-го дня после последней инъекции антигена, путем взятия по 40-50 мл крови, трехкратно, с интервалом 72 часа. Положительную сыворотку контролировали на стерильность, используя специальные питательные среды (отсутствие бактериального загрязнения и грибковой микрофлоры указывает на чистоту препарата). Активность сыворотки проверяли титрацией в РСК, РДСК, РНГА и ИФА.

Далее проводили постановку серологических реакций (РДСК) общепринятыми методами, используя в качестве исследуемого антигена суспензию клещей, а в качестве диагностикума положительную сыворотку.

В реакции использовались следующие компоненты:

суспензия исследуемого клеща, разведенная физиологическим раствором натрия хлорида в соотношении 1:5;

контрольный тейлерийный антиген, с последующим разведением физиологическим раствором натрия хлорида в соотношении 1:5;

• негативная (отрицательная) сыворотка;

сыворотка позитивная (положительная) в рабочем титре;

комплемент - сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная с добавлением 4%-ной борной кислоты или лиофильно высушенная);

гемолитическая сыворотка (гемолизин) - в утроенном титре;

эритроциты барана (3%-ная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе хлористого натрия).

Реакцию длительного связывания комплемента на холоде проводили в пробирках в объеме разведенной суспензии или контрольного антигена и комплемента по 0,2 см³, гемолитической системы - в оттитрованной рабочей дозе (по 0,4 см³).

Учет и оценка результатов реакции. Испытуемые пробы суспензии или контрольного антигена исследовали в разведениях 1:5 и 1:10 с позитивной сывороткой и 1:5 без сыворотки (контроль на антикомплементарность суспензии или контрольного антигена), при массовом исследовании реакцию проводили в одной пробирке в разведении суспензии 1:5 с антигеном.

Одновременно разливали суспензию клеща и контрольный антиген для титрования гемолитической системы. Необходимые разведения суспензии клеща и контрольного антиген готовили в порядке, как указано выше. Инактивирование разведенных проб суспензии клеща и контрольного антигена крови проводили при 62-64°С.

Комплемент применяли в рабочем разведении 1:25 или 1:30 (при титре в гемсистеме, указанном биопредприятием - 0,19 - 0,22).

Контроли реакции:

позитивный тейлерийный антиген в разведениях 1:5 и 1:10 с позитивной сывороткой и 1:5 без сыворотки;

гемолитическая система без суспензии клеща, позитивной сыворотки и комплемента.

Перед разливом гемолитической системы в пробирки с исследуемыми пробами суспензии клеща проводили титрование гемолитической системы на трех пробах суспензии клеща - негативной (без суспензии клеща), позитивной (тейлерийный антиген) и пробе суспензии клеща исследуемой партии.

У клещей, давших положительную реакцию, из суспензии клеща были микроскопически выявлены тейлерии, что свидетельствует о достоверности результатов исследования суспензии клеща и о более высокой его чувствительности.

Способ выявления инвазированности клещей тейлериями путем исследования суспензии клеща в серологических реакциях на примере РДСК оказался чувствительным и специфичным. С его помощью представляется возможность выявлять клещей-тейлерионосителей.

Результаты исследований защищены охранным документов Республики Казахстан: Патент №31736 - Способ выявления инвазированности клещей тейлериями, от 30.12.2016 г.

Заключение. Для уточнения эпизоотической ситуации по тейлериозу важное значение имеет наличие и видовой состав их переносчиков в регионе – кровососущих иксодовых клещей, а также степень их инвазированности тейлериями. Крупный рогатый скот, овцы имели довольно высокую заклещеванность, которая составила до 34,5% у крупного рогатого скота и до 28,8% у овец. Индекс обилия у них составил 14,6 экз./гол. и 1,4 экз./гол., соответственно. В общих сборах клещей преобладает вид Hyalommaanatolicum– основной специфический переносчик тейлерий, который составил 44,8% от всех собранных клещей. При исследовании клещей на инвазированность кровепаразитами установлено, что тейлерии обнаружены в мазках, приготовленных из гемолимфы клещей Dermacentormarginatus у 86,7%, из гемолимфы Haemaphysalispunctata у 53,3%, из гемолимфы клещей Hyalommaanatolicumу 46,7%. Данные по исследованию слюнных желез этих же экземпляров клещей коррелируются с данными исследования гемолимфы и составляют, соответственно, 73,3%, 53,3% и 40,0%. Исследование мазков, приготовленных из отложенных самками клещей яиц, показали зараженность тейлериями отложенных яиц у видов Hyalommaanatolicumи Dermacentormarginatus – 85,0% и 70,0%, соответственно.

Разработан способ определения тейлерий в иксодовых клещах.

Список литературы.

1. Dschunkowsky and Luhs.Theileria‐induced leukocyte transformation. 2003; 6: 377–382.

2. Hooshmand‐Rad P, Hawa NJ. Transmission of Theileria hirci in sheep by Hyalomma anatolicum anatolicum. Trop Anim Health Prod. 1973; 5:103–109.

3. Razmi GR, Hosseini M, Aslani MR. Identification of tick vectors of ovine theileriosis in an endemic region of Iran. Vet Parasitol. 2003; 116:1–6.

4. Шабдарбаева Г.С., Балгимбаева А.И. Иксодофауна и исследования по зараженности иксодид кровепаразитами//Материалы международной научно-практической конференции «Высшая школа и аграрная наука – сельскому хозяйству», посвященной 100-летию со дня рождения Садыкова Б.Х., 90-летию Федосеева В.С., 75-летию Абдильманова У.А., 21-24 мая 2009. Семей, 2009. С. 203-208.

5. Турганбаева Г.Е., Шабдарбаева Г.С., Ахметсадыков Н.Н., Хусаинов Д.М., Асылханов Д.У., Ахметжанова М.М. - Видовой состав и распространение иксодовых клещей в южных регионах Казахстана//ж «Ветеринария» №3(43)/2015. Алматы. С. 75-79.

6. Турганбаева Г.Е., Шабдарбаева Г.С., Ахметсадыков Н.Н., Кожаков К.К., Ахметжанова М.Н. – Степень зараженности пироплазмидами иксодовых клещей в Южно-Казахстанской и Алматинской областях Республики Казахстан//ж. Известия национальной академии Республики Казахстан. Серияаграрныхнаук. №6(36) 2016 г. С. 48-56.

7. Turganbayeva G.E., Akhmetsadykov N.N., Shabdarbaeva G.S., Khusainov D.M., Assylkhanov D.U., Akhmetzhanova M.N. Study of ixodid ticks on existence of blood parasites//j. International Scientific Publications. ISSN 1314-8591. Agruculture and Food, Volume 2, 20-24 juni 2016. Bulgaria, Burgas, 2016. P. 229-239.