XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

В последнее время лекарственные растения приобретают все больший интерес в отличие от химических препаратов. Растительное сырье является наиболее дешевым и доступным источником получения лекарственных препаратов, обладающих мягким терапевтическим действием и низкой токсичностью [1]. В связи с широким применением в медицине и косметической промышленности препаратов на основе лекарственных растений [2] спрос на лекарственное растительное сырье (ЛРС) продолжает возрастать с каждым годом. Это приводит к сильному увеличению торговли им как на внутреннем, так и на международном рынках. Только международный экспорт ЛРС в 2014 году составил 702,813 тонн, что соответствует 3,60 млрд. долларов США [3]. Европа является одним из главных импортеров ЛРС, хотя и сама выращивает ЛР на площади около 70000 га [4, 5].

Особый интерес среди лекарственных растений по своим фармокологическим свойствам представляет Шалфей лекарственный (Salvia officinalis L.). Разнообразие биологических свойств Шалфея лекарственного связано с богатым содержанием в нем полифенолов. Среди них различают олигомеры кофейной кислоты и дитерпены, производные карнозоловой кислоты. Шалфей лекарственный в народной медицине применяют для лечения туберкулеза легких, при бронхите, ангине, атеросклерозе, кровоточивости десен, сахарного диабета и других болезней [6]. Шалфей используют в кулинарии, в ликеро-водочной, рыбной, консервной промышленности, а также для отдушки чая и безалкогольных напитков и в качестве приправы к мясным блюдам [7].

Для сохранения биоразнообразия растений в связи с наблюдаемой тенденцией увеличения спроса на лекарственное сырье и ухудшения экологической ситуации разработка и использование биотехнологических методов размножения лекарственных растений является актуальным. В настоящей статье мы представили результаты по размножению в культуре invitro Шалфея лекарственного.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования является Шалфей лекарственный (Salvia officinalis L. сем. Lamiaceae Lindl). В качестве эксплантов использовали листья и отрезки стеблей из растения, выращенного в грунте. Для введения Шалфея лекарственного в культуру invitro использовали общепринятые методы культивирования тканей растений [8]. Для стерилизации эксплантов использовали два способа стерилизации с использованием 70% этанола и 0,5% раствора NaOCl, различающихся по времени выдержки в растворе 5 мин и 7 мин. После стерилизации экспланты переносили на стерильные питательные среды для каллусогенеза, среда Мурсига и Скуга (МС) [9] с различными концентрациями 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), (2,0 мг/л, 4,0 мг/л и 6,0 мг/л) и МС с 1,0 мг/л нафтилуксусной кислоты (НУК) и 8,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП). С целью получения микроклонов стерильные отрезки стеблей с боковыми почками посадили на среду ½ МС с 1,0 мг/л НУК.

Результаты исследования и их обсуждение

Стерилизация эксплантов. Исходный материал для введения в стерильную культуру in vitro был выбран из двух видов шалфея лекарственного. Это были шалфей лекарственный вида «Maxima» и обыкновенный лекарственный шалфей. Для данных растений было апробированы 2 способа стерилизации. Первый способ стерилизации эксплантов: 1) в мыльной воде – 3 мин; 2) под проточной водой – 5 мин; 3) в 70% этаноле – 1 мин, постоянно перемешивая; 4) в 0,5% растворе NaOCl – 5 мин; 5) промывка стерильной дистиллированной водой 3 раза. Второй способ стерилизации эксплантов: 1) в мыльной воде – 3 мин; 2) под проточной водой – 5 мин; 3) в 70 % этаноле – 1 мин, постоянно перемешивая; 4) в 0,5% растворе NaOCl – 7 мин; 5) промывка стерильной дистиллированной водой 3 раза. Затем экспланты переносили на фильтровальную бумагу и высушивали. После этого экспланты разрезали на части определенного размера (5-7 мм) и переносили их на питательную среду. При использовании первого способа стерилизации посажено всего 33 экспланта (30 листьев, 3 стебля) шалфея лекарственного. В этом случае наблюдали 100% инфицирование эксплантов. Процент стерильности эксплантов во втором способе стерилизации составил 70,23% (Таблица 1).

Таблица 1 – Влияние способа дезинфекции на получение асептических эксплантов Шалфея лекарственного.

Способ стерилизации эксплантов	Общее количество эксплантов	Количество эксплантов		Инфицированные экспланты				Стерильность эксплантов
		Лист	Стебель	Лист	Стебель	%	Лист		Стебель	% от общего количества
Первый способ	33	30	3	30	3	100	0		0	0
Второй способ	84	68	16	19	4	27,38	49		10	70,23

Таким образом, из двух использованных способов стерилизации во втором способе стерилизации эксплантов достигнута высокая степень стерильных эксплантов – 70,23%. Следовательно, для стерилизации эксплантов Шалфея отобран второй способ стерилизации.

Каллусогенез в культуре тканей Шалфея лекарственного. Полученные стерильные экспланты пересадили на свежие питательные среды МС с различными концентрациями 2,4-Д (2,0 мг/л; 4,0 мг/л; 6,0 мг/л) и МС с 1,0 мг/л НУК и 8,0 мг/л БАП.

В результате наиболее оптимальными для каллусогенеза оказались среды с низкой концентрацией ауксина: МС с 2,0 мг/л 2,4-Д и МС с 1,0 мг/л НУК и 8,0 мг/л БАП. Так на среде МС с 2,0 мг/л 2,4-Д каллусогенез составил 88,5% и на среде МС с 1,0 мг/л НУК и 8,0 мг/л БАП – 15%. Показано, что высокие концентрации 2,4-Д (4,0 мг/л и 6,0 мг/л) ингибируют индукцию каллусов. Из двух использованных типов эксплантов (лист и стебель) частота индукции каллусов из листьев оказалось высокой (82,6%) (Таблица 2).

Таблица 2 – Зависимость каллусогенеза от состава питательной среды и типа экспланта в культуре тканей Шалфея лекарственного.

Варианты среды МС	Количество эксплантов			Каллусогенез			% от общего количества эксплантов	Некроз тканей
	Общее	Лист	Стебель	Общий	Лист	Стебель		Общее кол-во	%
2,0 мг/л 2,4-Д	26	22	4	23	19	4	88,5	0	0
4,0 мг/л 2,4-Д	19	17	2	0	0	0	0	0	0
6,0 мг/л 2,4-Д	19	13	6	0	0	0	0	0	0
1,0 мг/л НУК + 8,0 мг/л БАП	20	16	4	3	0	3	15	4	23,5

Морфологическое изучение каллусных тканей. На среде МС с 2,0 мг/л 2,4-Д формировались беловато-зеленые каллусы. На среде МС с 1,0 мг/л НУК и 8,0 мг/л БАП образовались желтовато-коричневые каллусы. А на двух других средах с высоким содержанием 2,4-Д (4,0 мг/л и 6,0 мг/л) образование каллусов не наблюдали.

Таким образом, показано, что высокие концентрации 2,4-Д ингибируют каллусогенез, тогда как низкие концентрации стимулируют индукцию каллусов. Так, на среде МС с 2,0 мг/л 2,4-Д частота индукции каллусных тканей составила 88,5%. В культуре тканей шалфея лекарственного наблюдали формирование двух типов каллусных тканей: беловато-зеленого и желтовато-коричневого (Рисунок 1).

а б в

Рисунок 1 – (а, б) Формирование каллусных тканей на листовых эксплантах,

(в) Индукция растений-регенерантов из беловато-зеленого каллуса.

Индукция растений-регенерантов. Изучение способности к морфогенезу полученных двух типов тканей показало, что беловато-зеленые каллусы отличаются способностью к регенерации зеленых побегов. Данный тип тканей является морфогенным т.к. формирует побег и был получен на среде МС с 2,0 мг/л 2,4-Д. А другой тип ткани желтовато-коричневый, образовавшийся на среде МС с 1,0 мг/л НУК и 8,0 мг/л БАП, не обладает морфогенетической способностью. Таким образом, из двух типов каллусов по способности к морфогенезу отобран беловато-зеленый каллус, формирующий зеленые побеги (Рисунок 1).

Таким образом, среда МС с 2,0 мг/л 2,4-Д способствует образованию морфогенных беловато-зеленых каллусов. Тогда как среда МС с 1,0 мг/л НУК и 8,0 мг/л БАП приводит к формированию неморфогенных желтовато-коричневых каллусов.

Микроклональное размножение Шалфея лекарственного. Микроклональное размножениеявляется одним из способов вегетативного размножения растений в условиях invitro. Для микроклонального размножения были использованы отрезки стеблей, полученных из растений, растущих в грунте. Стерилизацию эксплантов проводили с помощью первого способа стерилизации (в 70% этаноле – 1 мин и 0,5% раствора NaOCl – 7 мин). Затем, стерильные экспланты – отрезки стеблей посадили на среду ½ МС с 1,0 мг/л НУК. Через 4 дня наблюдали развитие микроклонов с появлением новых стеблей и листьев (Рисунок 2). Для укоренения полученные черенки пересажены на среду МС без гормонов.

а б в

Рисунок 2 – (а) Отрезки стеблей, посаженные на среду ½ МС с 1,0 мг/л НУК,

(б, в) Развитие микроклонов (через 4 дня после посадки).

Таким образом, нами оптимизирован способ стерилизация эксплантов, получены морфогенные каллусные ткани и проведено микроклональное размножение Шалфея лекарственного. Так, нами отобран второй способ стерилизации эксплантов, где достигнут высокий процент получения стерильных эксплантов – 70,23%. Следовательно, мы предлагаем для стерилизации эксплантов Шалфея второй способ стерилизации, заключающийся в использовании 70% этанола (1 мин) и 0,5% раствора NaOCl (7 мин).

Показано, что высокие концентрации 2,4-Д ингибируют каллусогенез, тогда как низкие концентрации стимулируют индукцию каллусов в культуре тканей Шалфея лекарственного. Наиболее оптимальной для каллусогенеза явилась среда МС с 2,0 мг/л 2,4-Д, где частота индукции каллусных тканей составила 88,5%. В культуре тканей шалфея лекарственного идентифицировано формирование двух типов каллусных тканей: морфогенный беловато-зеленый и неморфогенный желтовато-коричневый. Отмечено, что морфогенные беловато-зеленые каллусы обладают способностью к регенерации растений. Получены положительные результаты по микрокональному размножению Шалфея лекарственного, так стерильные отрезки стеблей, высаженные на среду ½ МС с 1,0 мг/л НУК, успешно развивались, образуя новые стебли и листья.

Научные руководители: Амирова А.К., Лесова Ж.Т.

Список литературы

1 Растительные лекарственные средства / Под ред. Н.П. Максютиной. – Киев, 1985. – 278 с.

2 Интернет ресурс http://www.neboleem.net/fitoterapija.php.

3 Vasisht K, Sharma N, Karan M. Current Perspective in the International Trade of Medicinal Plants Material: An Update //Curr. Pharm. Des., 2016. – Vol. 22. – No. 27. – P. 4288-336.

4 Bogers R.J., Cracker L.E., Lange D. Medicinal and Aromatic Plants // Agricultural, Commercial, Ecological, Legal, Pharmacological and Social Aspects. – Dortrecht, The Netherlands.: Springer, 2006. – P. 75-92.

5 Spychalski G. Determinants of growing herbs in Polish agriculture // Herbapolonica. - 2013. - Vol. 59. – No. 4. – P. 5-18.

6 Интернет ресурс: https://cyberleninka.ru/article/n/diterpeny-i-polifenoly-shalfeya-lekarstvennogo-perspektivy-meditsinskogo-primeneniya-obzor-literatury

7 Интернет ресурс: https://ru.wikipedia.org/wiki/Шалфей лекарственный.

8 Калинин Ф.Л., Сариацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. – Киев: Наук. думка, 1980. – 488 с.

9 Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures //Physiologia plantarum, 1962. – Vol. 15(3). – P. 473-497.

Код для цитирования: Скопировать