XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

На сегодняшний день выявление, изучение лекарственных растений с целью получения сырья для медицины является одной из самых приоритетных проблем государства. В настоящее время около 40% всех лекарственных препаратов получают из растений. Как бы ни были эффективны лекарственные средства химического происхождения, лекарства из растительного сырья для лечения некоторых болезней незаменимы, например, при сердечно-сосудистых заболеваниях, болезнях органов пищеварения. Проблема расширения ассортимента и увеличения производства лекарственных препаратов в Республике рассматривается как одна из высокоперспективных, так как из 3000 препаратов, применяющихся в медицинской практике, лишь 3% производится в Казахстане [1].

Естественная флора, являвшаяся основным и сравнительно дешевым поставщиком растительного сырья, в настоящее время не в состоянии удовлетворить растущий спрос со стороны фармацевтики. В этой связи поиск новых нетрадиционных методов получения лекарственного сырья, в том числе с использованием методов культуры тканей in vitro, представляется интересным в практическом и теоретическом плане [2].

Наряду с традиционными способами размножения семенами применение биотехнологических методов размножения лекарственных растений способствует получению безвирусного посадочного материала, а также накоплению биомассы ценного лекарственного сырья для фармации без ущерба для естественной лекарственной флоры.

В связи с этим разработка способов размножения в культуре invitroценного лекарственного растения Codonopsis clematidea Schrenk, издавна используемого в народной медицине, кулинарии и как садовое декоративное растение, представляет особый интерес. 

Codonopsisclematidea Schrenk (Кодонопсис клематисовидный) – многолетнее вьющееся растение со стелющимися побегами, семейства колокольчиковых. Имеет прямой или извилистый стебель достигает в длину 50–70 см. Листья небольшие, яйцевидные или широколанцетные, цельнокрайние. Цветки – верхушечные колокольчики, одиночные, крупные и поникающие, сизо-зелёного оттенка с темно-синими жилками. Плод растения – коробочка, семена – гладкие, бледно-бурого окраса. Природный ареал распространения данного вида – Средняя Азия[3].

Codonopsis clematidea Schrenk относится к роду Сodonopsis, принадлежащий семейству Campanulaceae и представляет собой род, содержащий 42 вида двудольных травянистых многолетних растений. Некоторые виды Codonopsis широко используются в традиционной медицине и, как считается, обладают лечебными свойствами. Фитохимические исследования показали, что виды Codonopsis содержат в основном полиацетилены, фенилпропаноиды, алкалоиды, тритерпеноиды и полисахариды, которые обладают биологической активностью [4].

Так, из литературы известно, что в Узбекистане проводятся исследования по изучению возможности получения культуры тканей в условиях invitroи биомассы Codonopsis clematidea Schrenk, пригодной для использования в практике. Также был проведен сравнительный химический анализ растений С. clematidea Schrenk, выращенных в условиях in vivo и in vitro. В результате ими было показано, что дифференцированные ткани культуры in vitro С. clematidea Schrenk содержат пигменты, липиды и алкалоиды, свойственные растениям, выращенным invivo.Это позволяет полагать, что культура invitro в перспективе может служить источником ценного лекарственного препарата из С. clematidea Schrenk. Кодонопсис является основным компонентом гепатозащитного лекарственного сбора (ЛСХ-1 - лекарственного сбора Ходжшатова), разработанного и внедренного в официальную медицину Институтом ботаники АК РУз [5].

В Казахстане подобные исследования по введению в культуру invitro Codonopsis clematidea Schrenk нами впервые начаты в Алматинском Технологическом Университете.

В данной статье представлены результаты размножения в культуре invitroценного лекарственного растения Codonopsis clematidea Schrenk.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили растения CodonopsisclematideaSchrenk, выращенные в грунте. В качестве эксплантов для введения в культуру invitroиспользовали семена и стерильные проростки, полученные из семян CodonopsisclematideaSchrenk.

Семена стерилизовали в 0,5% гипохлорите натрия (2 мин). После стерилизации семена переносили на питательные среды ½ МС (Мурасиге и Скуга) [6] и МС без фитогормонов. Отрезки листьев и стеблей, полученных из асептических проростков, пересаживали на среду для каллусогенеза МС с различными концентрациями 2,4-Д (2,0 мг/л, 4,0 мг/л и 6,0 мг/л) в сочетании с 0,5 мг/л БАП в различных комбинациях: среда МС4, содержащая 4,0 мг/л 2,4-Д+ 0,5 мг/л БАП и среда МС6, содержащая 6,0 мг/л 2,4-Д + 0,5 мг/л БАП.

Для микроклонального размножения стерильные проростки переносили на питательную среду МС без гормонов. Наблюдения за ростом и развитием пробирочной культуры CodonopsisclematideaSchrenk проводили каждую неделю и фиксировали результаты. В каждом варианте повторность опыта трехкратная. 

Результаты и их обсуждение

Стерилизация эксплантов и получение асептических проростков С. clematidea Schrenk. Стерилизацию семян проводили в 0,5%растворе гипохлорита натрия в течение 2 мин в ламинар-боксе. Затем семена промывали четыре раза стерильной дистиллированной водой и высушивали на фильтровальной бумаге. После стерилизации семена помещали на агарозные среды: Мурасиге и Скуга (МС), содержащую половинчатый набор солей (½ МС) с 1,0 мг/л нафтилуксусной кислоты (НУК) без органических добавок и МС с полным набором солей без фитогормонов. Пробирочные культуры выращивали в светокультуральной комнате при 16/8 часовом фотопериоде.

Через три дня на среде ½ МС наблюдали появление проростков с листочками, на седьмой день наблюдали развитие корней. Эффективность стерилизации составила 100%, а процент всхожести семян также составил 100% (Рисунок 1). На среде МС без фитогормонов семена не прорастали.

Рисунок 1 – Развитие семян CodonopsisclematideaSchrenk на питательной среде ½ МС

Высадка стерильных эксплантов для получения каллусной ткани С. clematidea Schrenk. Асептически выращенные проростки использовали для иссечения эксплантов. Эксплантами для введения в культуру in vitro служили различные органы растений: листовые сегменты и сегменты стеблей, взятые из асептических растений, выращенных из семян. Экспланты высаживали на стерильные питательные среды в пробирках. Для культивирования эксплантов в качестве основной среды использовали среду Мурасиге и Скуга (МС). С целью оптимизации гормонального состава питательной среды для каллусогенеза былы изучены различные варианты сред с разными комбинациями и концентрациями следующих фитогормонов: бензиламинопурина (БАП) и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д).

Из стерильных проростков отрезали листовую пластинку и стебли, переносили на различные питательные среды. Для индукции каллусной ткани отрезки листьев и стеблей культивировали на питательных средах МС4 с 4,0 мг/л 2.4-Д + 0,5 мг/л БАП и МС6 с 6,0 мг/л 2,4-Д+ 0,5 мг/л БАП.

Через 7 дней наблюдалась 30 % индукция каллусной ткани из стеблевых эксплантов на МС6 с 6,0 мг/л 2,4-Д+ 0,5 мг/л БАП. На МС4 с 4,0 мг/л 2,4-Д+ 0,5 мг/л БАП индукция каллусов не наблюдалась (Рисунок 2).

Рисунок 2 – Каллусогенез из отрезков листьев и стеблей и морфология каллусов

CodonopsisclematideaSchrenk

Таким образом, нами показано, что из двух использованных питательных сред наиболее оптимальным для индукции каллусных тканей является среда МС6 с 6,0 мг/л 2,4-Д+ 0,5 мг/л БАП.

Изучение морфогенетических способностей полученных каллусных тканей. На среде МС6 с 6,0 мг/л 2,4-Д + 0,5 мг/л БАП образовался один тип ткани – рыхлый, беловато- прозрачный каллус (Рисунок 2).

Получение микроклоновС. clematideaSchrenk. Стерильные отрезки стеблей с апикальными и боковыми почками, полученные из стерильных семян помещали на среду МС с 1,0 мг/л НУК + 8,0 мг/л БАП. Через 3-4 дня наблюдали появление корней, удлинение стеблей и индукцию новых листьев (Рисунок 3).

Рисунок 3 – Удлинение побегов, образование новых листьев и укоренение микроклонов CodonopsisclematideaSchrenk.

В результате микроклонального размножения CodonopsisclematideaSchrenk достигнуто 85,7% укоренения микроклонов. В отличие от изученных литературных данных по размножению С. clematidea Schrenk в условиях invitroнами разработаны ускоренные способы получения каллусной ткани и укоренения микроклонов. Нами достигнуто индукция каллусных тканей за 7 дней, в отличие от протокола, разработанного Wojciech Slupski и др. [6], согласно которому каллусогенез наблюдается через 42 дня после высадки эксплантов.

Таким образом, разработанный нами ускоренный способ микроклонального размножения CodonopsisclematideaSchrenk, заключается в получении стерильных проростков из семян и их выращивании в условиях invitro, которые занимают 14 дней, а получение и укоренение стерильных микроклонов – 7 дней. Всего требуется 21 дней для получения пробирочных микроклонов С. сlematidea Schrenk.

Научные руководители: Амирова А.К., Лесова Ж.Т.

Список литературы

1 Атажанов Д.М. Культура IN VITRO лекарственных растений RUTA GRAVEOLENS L. и CODONOPSIS CLEMATIDEA SCHRENK: [Электронный ресурс].1997. URL: http://earthpapers.net/kultura-in-vitro-lekarstvennyh-rasteniy-ruta-graveolens-l-i-codonopsis-clematidea-schrenk#ixzz5fKMQIKOp (29.01.2019).

2 АтажановД.М. КультураIN VITRO лекарственныхрастений RUTA GRAVEOLENS L. и CODONOPSIS CLEMATIDEA SCHRENK: [Электронныйресурс].1997. URL: http://earthpapers.net/kultura-in-vitro-lekarstvennyh-rasteniy-ruta-graveolens-l-i-codonopsis-clematidea-schrenk#ixzz5fKMQIKOp (31.01.2019).

3 Электронный ресурс: https://ru.wikipedia.org/wiki/Кодонопсис (05.02.2019).

4 Jing-Yu He. Na Ma. Shu Zhu. Katsuko Komatsu. Zhi-Yuan Li and Wei-Ming FuThe genus Codonopsis (Campanulaceae): a review of phytochemistry, bioactivity and quality control //Journal of Natural Medicines, 2015. – Vol. 69. – P. 1–21. doi: 10.1007/s11418-014-0861-9.

5 Murashige, T & F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia plantarum 15(3):473-497

6 Интернет ресурс: https://www.researchgate.net/profile/Adam_Matkowski/publication/26951 2737_Micropropagation_of_Codonopsis_pilosula_Franch_Nannf_by_Axillary_Shoot_Multiplication/links/5661646108ae418a7866c762/Micropropagation-of-Codonopsis-pilosula-Franch-Nannf-by-Axillary-Shoot-Multiplication.pdf?origin=publication_detail., 2011.

Код для цитирования: Скопировать