XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

В мире рак печени является пятой локализацией по числу ежегодно регистрируемых новых случаев (437 тыс. или 5,4% от всех злокачественных заболеваний) и четвертой по количеству смертей (427 тыс. или 8,2%) [1.4.5]. Ежегодно в мире выявляют около 800 тыс. больных. В России гепатоцеллюлярный рак составляет 1,7–2,5% всех злокачественных новообразований [1,2]. Метастатическое поражение печени выявляется у 20-70% онкологических больных [1]. Резекция печени в большинстве случаев остается основным методом лечения, но радикальную операцию удается выполнить только у 60-70% [2.4]. Опуская крайние варианты, частота развития пострезекционной печеночной недостаточности варьирует в пределах от 0,7 до 9,1% [3.5.6]. Пятилетняя выживаемость больных с данным осложнением в лучших клиниках мира не превышает 38-50% [2.5.6].

Таким образом, на современном этапе развития медицины, поиск новых методов стимуляции репаративной регенерации печени остается актуальной задачей, решение которой приведет к уменьшению сроков восстановления печеночной ткани, снижению риска развития печеночной недостаточности.

Цель исследования. Повышение эффективности профилактики пострезекционной печеночной недостаточности, путем потенцирования метилирования ДНК гепатоцитов цианокобаламином.

Материалы и методы. Эксперименты проводили на 54 лабораторных животных – половозрелых самцах крыс линии Wistar, которых разделили на 3 группы по 18 в каждой. Всем животным осуществляли типичную резекцию в объёме 70% от исходной массы печени. В 1-й группе лечение не проводилось и она рассматривалась как контрольная. Во 2-й группе непосредственно после резекции в сохраненные доли печени вводили 0,9% раствор хлорида натрия. В 3-й группе животных интраоперационно в паренхиму сохранённых долей печени вводили витамин B₁₂ в концентрации 200 мкг/мл. Животных выводили из эксперимента на 1-е, 7-е и 14-е сутки после операции, взвешивали массу регенерировавшей печени, производили забор крови для оценки биохимических показателей (билирубин, щелочная фосфатаза, аминотрансферазы, гамма-глутамил-транспептидаза, холестерин, белки, глюкоза, мочевина, креатинин), и факторов роста (IL- β и TGF- β1). Осуществляли оценку показателей окислительного стресса (МДА, SH-группы, СОД, ДНФГ). Также производили взятие гистологического материала (паренхимы печени). Изучали морфологические особенности резецированной печени, проводили оценку пролиферативной активности гепатоцитов - иммуногистохимическое исследование (окрашивание Ki-67). Статистическая обработка выполнялась с помощью пакета «Описательная статистика» программы Excel, для оценки достоверности различий рассчитывали критерий сравнения Стьюдента. Достоверными считались различия при p<0,05.

Результаты. При оценке регенерировавшей массы печени на момент выведения животных из эксперимента в контрольной группе животных на 1 сутки отмечается восстановление 36,38%±3,06% от исходной массы печени, во 2-й группе – 41,91%±5,02%, в 3-й группе - 46,33%±2,35%; к 14 сутки в 3-й группе животных наблюдается практически полное восстановление массы печени - 94,26%±2,96%, в сравнении с контрольной группой (80,98%±4,63%) (рис. 1).

При проведении биохимического анализа крови к 14 суткам исследования отмечается нормализация уровней следующих показателей: билирубин, АСАТ, АЛАТ, креатинин, мочевина, холестерин в 3-й группе животных, в сравнении с контрольной группой, в которой нормализации показателей не наблюдается. При оценке уровня в крови животных цитокина IL- β в 3 группе животных отмечается нарастание содержания с 1 по 14 сутки (26,44±2,6 пг/мл – 1-е сутки, 89,33±9,78 пг/мл – 14-е сутки), в 1-й и 2-й группах животных наибольший показатель наблюдается на 7 сутки 35,24±7,39 пг/мл и 62,22±8,12 пг/мл соответственно (рис. 2,3). При внутрипеченочном введении цианокобаламина на 1-е сутки исследования экспрессия TGF- β1повышается в 2 раза в сравнении с контрольной группой.

Рис. 1. Динамика восстановления массы печени после типичной резекции.

При оценке показателей окислительного стресса в 3 группе животных в сравнении с контрольной группой к 14 суткам исследования отмечается снижение уровней МДА на 17,12%±3,5% и ДНФГ на 12,33%±4,08%, повышение уровней СОД и SH-групп на 30,17%±4,03% и 21,56%±3,75% соответственно. Полученные результаты биохимического исследования крови свидетельствуют о восстановлении обменных процессов в печени к 14 суткам исследования. Усиление экспрессии TGF- β1 и IL- β при введении цианокобаламина способствует ускорению процессов репаративной регенерации, т.к. данные факторы являются первичными митогенами, активирующими митотическое деление. Снижение уровней МДА и ДНФ, повышение уровней СОД и SH-групп свидетельствует о снижении окислительного стресса.

При световой микроскопии биоптатов печени окрашенных гематоксилином-эозином на 1 сутки исследования, выявлено наличие одноядерных и двуядерных гепатоцитов в соотношении 9:1. Значительное увеличение количества двуядерных гепатоцитов к 14 суткам отмечается в 3-й группе животных (21,3%±3,68%), в сравнении с контрольной группой (12,71%±5,51%). Это связано с тем, что при внутрипеченочном введении витамина В₁₂ в митотический цикл вступают не только способные к активному делению гепатоциты, но и стареющие, что приводит к незавершенному митозу и образованию двуядерных клеток. Так как общим принципом репаративной регенерации является прежде всего восстановление суммарного тканевого генома, полиплоидизацию, получаемую в данном случае, можно назвать эквивалентом клеточного размножения.

Рис. 2. Оценка уровня в крови животных цитокина IL- β (* - p<0,05 при сравнении 2-й контрольной группы с 1-й контрольной группой; ** - p<0,05 при сравнении 1-й опытной группы с 1-й контрольной группой).

Рис. 3. Оценка уровня в крови животных экспрессии TGF- β1 (* - p<0,05 при сравнении 2-й контрольной группы с 1-й контрольной группой; ** - p<0,05 при сравнении 1-й опытной группы с 1-й контрольной группой).

При иммуногистохимическом исследовании ткани регенерировавшей печени отмечается повышение пролиферативной активности одноядерных и двуядерных гепатоцитов после типичной резекции во всех экспериментальных группах. На 14 сутки исследования наибольшая пролиферативная активность наблюдается при введении цианокобаламина (индекс пролиферации одноядерных гепатоцитов – 6,22%±0,54%, двуядерных гепатоцитов - 0,059%±0,034%) в сравнении с контрольной группой (индекс пролиферации одноядерных гепатоцитов - 2,54±0,29%, двуядерных гепатоцитов - 0,039±0,027%). Полученный результат подтверждает повышение пролиферативной активности гепатоцитов при внутрипеченочном введении цианокобаламина.

Заключение. Предложенный метод улучшения эффективности профилактики пострезекционной печеночной недостаточности обеспечивает наиболее быстрое восстановление анатомической и функциональной целостности печени. Потенцирование метилирования ДНК к 14 суткам исследования приводит к восстановлению 94,26%±2,96% от исходной массы печени, нормализации уровня биохимических показателей крови, повышению выработки фактора роста TGF-beta1, усилению активности цитокинов, снижению окислительного стресса, повышению пролиферативной активности гепатоцитов.

Список литературы:

О.Г. Суконко, П.И. Моисеев, Т.Ф. Мигаль, Г.В. Якимович, Т.Н. Кирпиченко Рак в Европе: взгляд на проблему, сравнительный анализ некоторых показателей. Поволжский онкологический вестник. 2012, №3

Андреев А.А., Лаптиёва А.Ю., Остроушко А.П. Репаративная регенерация печени после оперативного лечения первичных опухолей и метастатическом поражении печени.Многопрофильный стационар. 2018. Т. 5. № 2. С. 100-104.

Вишневский В.А., . Анатомические сегментарные резекции при метастазах колоректального рака в печень//Анналы хирургической гепатологии. -2010. -Т. 15. -№ 3. -С. 48-57. 

Michalopoulos G.K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis / G.K. Michalopoulos // Comprehensive Physiology. – 2013. – №3. – C. 485-513.

Taub R. Liver regeneration 4: transcriptional control of liver regeneration / R. Taub // The FASEB Journal. – 1996. – Т. 10, № 4. – С. 413-427.

Fausto N. Liver regeneration. 2. Role of growth factors and cytokines in hepatic regeneration / N. Fausto, A.D. Laird, E.M. Webber // The FASEB Journal. – 1995. – Т. 9, № 15. – С. 1527-1536