XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

Род дымянка (Fumaria) сем. Fumariaceae представлен около 46 видами, наибольшее значение имеет дымянка лекарственная (F. officinalisL.).Она представляет собой однолетнее травянистое растениес прямостоячим ветвистым стеблем, высотой 20-40 см. Распространено повсеместно в Европейской части России, Кавказе, во всех районах Западной и Восточной Сибири. Растение сорное в посевах в районах северной и центральной лесостепи, растет у дорог и населенных пунктах[1].

Согласно литературным данным химический состав надземной части дымянки лекарственной представлен фенолкарбоновыми (кофейная, хлорогеновая) кислотами, фумаровой кислотой, флавоноидами до 1% (рутин, кверцетин), алкалоидами изохинолинового ряда до 1,6%.[1]. Ее применение в официальной медицине связано с наличием алкалоидов, производных изохинолина (протропина, фумарилина и др.), обладающих гепатопротекторной, спазмолитической и анальгезирующей активностью. Экстракт дымянки входит в состав лекарственного средства «Гепабене»^®. Сырье дымянки лекарственной –Fumitory – включено в Европейскую и Британскую Фармакопеи.

В последнее время появились сообщения о противоэкзематической и противовоспалительной активности экстрактов F. indica и F. рarviflora, основанной на комплексном действии суммы полифенольных соединений (флавоноиды, дубильные вещества и др.), алкалоидов и фумаровой кислоты [2,3]. В этой связи обоснован интерес к изучению дымянки лекарственной в целях получения новых фитопрепаратов для лечения дерматологических заболеваний.

Цель данного исследования заключалась в изучении качественного и количественного состава БАС травы дымянки лекарственной, обладающих противовоспалительной активностью.

Материалы и методы. Материалом для исследования служила трава дымянки лекарственной, собранная в фазу цветения в июле-августе 2017 года в окрестностях г. Кемерово. Растительное сырье собирали в сухую, ясную погоду и сушили до воздушно-сухого состояния. Сырье упаковывали в пакеты из крафт-бумаги и хранили в сухом прохладном месте. Сырье представляет собой смесь цельных кусочков или частично измельченных веточек, листьев, кусочков стеблей толщиной до 0,3 мм и цветков. Образцы измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм.

Для проведения идентификации БАС получены водные и водно-спиртовые извлечения 40% и 70% растворами этанола. Водные извлечения использовали для выделениясуммы дубильных веществ методом колоночной хроматографии [4] и последующей идентификации, водно-спиртовые извлечения – для определения флавоноидов[5]. Фумаровую кислоту из растительного сырья экстрагировали 95% этанолом в соотношении 1:5 при нагревании на водяной бане в течение 30 минут.

Фракцию, содержащую алкалоиды, получали экстракцией 5,0 г измельченного сырья 5 мл разбавленного аммиака и 50 мл хлороформа в течение 15 минут. Хлороформное извлечение подкисляли 5 мл 5% раствора серной кислоты, водный слой отделяли и использовали для качественных реакций на алкалоиды.

Фитохимический анализ проводили общепринятыми методами [6].

ТСХ выполняли на пластинах Sorbfil ПТСХ-АФ-А. Использовали денситометр с осветительной камерой Сорбфил КС 4.00.000 в условиях освещения лампами DULUX 7W/21 840 OSRAM (белого света) с системой фотофиксации Sony (HandycamHDR-CX405) и ТВ тюнером EasyCap (ООО «ИМИД», Россия). Обработку изображения осуществляли с применением ПОSorbfilTLCView. Элюция осуществлялась в системах растворителей: для агликонов флавоноидов: толуол-этилацетат-ледяная уксусная кислота (70:25:5); для гликозидов флавоноидов: этилацетат-ледяная уксусная кислота-вода (5:1:1); для фумаровой кислоты: муравьиная кислота-хлороформ-бутанол-гептан (12:16:32:44); для алкалоидов изохинолинового ряда: хлороформ-метанол (8:2). Аппликацию стандартного раствора на линию старта осуществляли с помощью микрошприца МШ-10 (ООО Цвет, Дзержинск, Россия) используя объем нанесения 2,5-17,5 мкл применяя аппликатор механический Sorbfil совместно используя нагревательное устройство УСП-1. Проявление зон адсорбции осуществляли следующими способами: просматривали в УФ-свете и отмечали собственную флуоресценцию соединений; просматривали в видимом и УФ-свете после обработки 5% спиртовым раствором алюминия хлорида (флавоноиды); обрабатывали 1% спиртовым раствором метилового красного (фумаровая кислота); просматривали в видимом и УФ-свете после обработки реактивом Драгендорфа.

Для количественного определения дубильных веществ в водном извлечении из травы дымянки лекарственной использовали перманганатометрическое титрование и спектрофотометрический метод (метод Folin-Ciokalteu), основанный на восстановлении смеси фосфорновольфрамовой и фосфорномолибденовой кислот в щелочной среде по методикам 1 и 2 ОФС.1.5.3.0008.15 «Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах». Расчет количественного содержания суммы полифенольных соединений проведен в пересчете на галловую кислоту. Измерения проводили на фотоэлектроколориметре КФК-3 (Россия)

УФ-спектры снимали на спектрофотометре СФ-2000 (Россия).Все измерения выполнены в трехкратной повторности. Статистическую обработку результатов измерения проводили согласно требованиям ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов эксперимента».

Результаты и обсуждение.

При проведении качественных реакций в водном извлечении травы дымянки лекарственной установлено, что при взаимодействии с 1% растворомжелатина появлялась опалесценция, исчезающая от избытка реактива; с 1% раствором хинина гидрохлорида возникаламорфный осадок; с 1% раствором железоаммониевыхквасцов – черно-синееокрашивание (гидролизуемые дубильные вещества) и осадок; при добавлении смеси разведенной хлористоводородной кислоты и 40% раствора формальдегида после кипячения осадок не образуется; с 10% раствором уксусной кислоты и 10% раствором средней соли свинца ацетатаобразуется осадок (гидролизуемые дубильныевещества), осадок отфильтровывали, к фильтрату добавляли1% раствор железоаммониевых квасцов и 0,1 г свинца ацетата – черно-синее окрашивание (гидролизуемые дубильные вещества); в
извлечение прибавляли натрия нитрат и 0,1 М кислоты хлористоводородной – бурое окрашивание (гидролизуемые дубильные вещества). На основании проведенных качественных реакций в исследуемомизвлечении травы дымянки обнаружена группа дубильных веществ гидролизуемого типа.

Количественное содержание суммы дубильных веществ, определенное методом перманганатометрии составило 3,955±0,49 %, спектрофотометрическим методом Folin-Ciokalteu – 2,80±0,017%.

На основании проведенных качественных реакций сделано предположение о наличии в водно-спиртовом извлечении травы дымянки лекарственной флавоноидов, представленных группой флавонов, флавонолов, 5-оксифлавонолов и 5-оксифлавонов (табл.1).

Таблица 1. Результаты качественных реакций на флавоноиды в водно-спиртовом извлечении травы дымянки лекарственной

Реакция	Эффект реакции для различных групп флавоноидов	Эффект
Цианидиновая проба	Флавонолы, флавоны, флавононы– красное или оранжевое окрашивание	Оранжевое окрашивание
Реакция по Брианту	Агликоны флавонолов, флавонлов, флавононов - красное или оранжевое окрашивание слоя октилового спирта	Оранжевое окрашивание слоя октилового спирта
Реакция с раствором NaOH	Флавоны и флавонолы – желтое окрашивание	Желтое окрашивание
Реакция с реактивом Вильсона	5-оксифлавоны, 5-оксифлавонолы – ярко-желтое окрашивание с красноватой флуоресценцией	Желтое окрашивание с красноватой флуоресценцией
Реакция с 5% раствором алюминия хлорида	Флавоны, флавонолы, халконы – желтое окрашивание с ярко-желтой флуоресценцией	Желтое окрашивание и характерная флуоресценция

В результате проведения хроматографии в тонких слоях сорбента (ТСХ) в системе для гликозидов флавоноидов после обработки 5% раствором AlCl₃обнаружено 6 зон адсорбции имеющих ярко-желтую флуоресценцию. Зона адсорбции с Rf-0,45 совпала с РСО рутина. Для определения агликонов флавоноидов, содержащихся в извлечении травы дымянки, использовали подвижную фазу толуол-этилацетат-ледяная уксусная кислота (70:25:5). На хроматограмме после обработки 5% раствором AlCl₃ присутствуют 5 зон адсорбции с зеленовато-желтой флуоресценцией в УФ-свете. Зона адсорбции с Rf-0,27 совпадает с РСО кверцетина.

В УФ -спектре 70% водно-спиртового извлечения из травы дымянки наблюдалось два максимума поглощения при λ = 288 и 324 нм, характерных для флавонов и флавонолов. При использовании шифт-пробы с раствором алюминия хлорида наблюдался батохромный сдвиг второй полосы поглощения на 91 нм, что свидетельствует о наличии свободной гидроксильной группы в 5 положении флавонов и флавонолов.

Хроматография спиртового извлечения из травы дымянки лекарственной в системе растворителей муравьиная кислота-хлороформ-бутанол-гептан (12:16:32:44) после проявления 1% спиртовым раствором метилового красного показала наличие фумаровой кислоты (Rf-0,87).

В извлечении из травы дымянки лекарственной с помощью осадительных реактивов подтверждено наличие алкалоидов. При взаимодействии с 1% раствором танина появлялась желтоватая опалесценция, исчезающая от избытка реактива; с реактивом Драгендорфа возникал оранжевый осадок; с реактивом Вагнера-Бушарда – бурый осадок; с 1% раствором пикриновой кислоты – желтый кристаллический осадок; при добавлении раствора фосфорно-вольфрамовойкислоты выпадал беловатый аморфный осадок.

Из литературных данных известно, что алкалоиды дымянки лекарственной по химической структуре относятся к алкалоидам изохинолинового ряда (рис.1), обладающим выраженной противовоспалительной активностью [7].

Протропин	Фумарилин	Фумаритин

Рис.1. Структура алкалоидов, выделенных из травы дымянки лекарственной [1].

Нами была изучена возможность использования специальных реактивов для идентификации данной группы алкалоидов. При взаимодействии с концентрированной серной кислотой при нагревании наблюдалось фиолетовое окрашивание; с концентрированной азотной кислотой появлялось желтое окрашивание; при добавлении реактива Эрдмана – сине-фиолетовое окрашивание при нагревании; с реактивом Марки наблюдали образование оранжево-красного окрашивания; реактив Манделина окрашивал извлечение в сине-зеленый цвет.

Рис.2. Хроматограмма извлечения из травы дымянки лекарственной и профиль ее денситометрического сканирования после обработки реактивом Драгендорфа в УФ - свете при λ = 366нм.

Хроматографическое разделение извлечения, полученного для определения алкалоидов травы дымянки, проводили методом ТСХ. Результаты оценивали до и после обработки реактивом Драгендорфа при просмотре в УФ - свете c применением программной обработки сканированных изображений хроматограмм с помощью компьютерной программы SorbfilTLCView[8]. На хроматограмме обнаружено 4 доминирующих зоныадсорбции алкалоидов, окрашенные в оранжево-красный цвет, с Rf 0,02; 0,09; 0,29 и 0,57 (рис.2).

Таким образом, в результате проведенного исследования, подтверждено наличие основных групп БАС травы дымянки лекарственной, проявляющих противовоспалительную активность – флавоноиды, дубильные вещества, фумаровая кислота и алкалоиды изохинолинового ряда. Перспективным для получения фитопрепатратов противовоспалительного действия на основе травы дымянки является использование экстрагентов с высоким содержанием этанола, позволяющих получить весь спектр БАС дымянки и максимально повысить фармакологическое действие.

Список литературы

Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т.1 / Отв. ред. А.Л. Буданцев. – СПб.; М.: Товарищество научных изданий КМК, 2008. – С. 87-88.

JowkarF., Jamshidzadeh A., MirzadehYazdi A., Pasalar M. The effects of Fumaria parviflora L extract on chronic hand eczema: A randomized double-blind placebo controlled clinical trial. Iranian Red Crescent Medicial Journal. 2011. vol.13. no 11. P.824-828.

Rizvi W, Fayazuddin M, Singh O, Syed SN, Moin S, Akhtar K, Kumar A. Antiinflammatory effect ofFumaria parvifloraleaves based on TNF-α, IL-1 , IL-6 and antioxidant potential.Avicenna J Phytomed, 2017; vol. 7(1). P. 37-45.

Антипенко Е.М., Кузнецов П.В. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ. Сообщение VI. Перспективы жидкостной колоночной хроматографии дубильных веществ (обзор). Химико-фармацевтический журнал.1995. Т.29. № 9. С.53.

Мальцева Е.М., Егорова Н.О., Егорова И.Н. Количественное определение суммарного содержания флавоноидов в траве кровохлебки лекарственной // Вестник уральской медицинской академической науки. №3/1. 2011. С.68.

Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. Химический анализ лекарственных растений. М., 1983. 176 с.

Bae DS, Kim YH, Pan CH, Nho CW, Samdan J, Lee JY&JK.  Protopine reduces the inflammatory activity of lipopolysaccharide-stimulated murine macrophages.  BMB Rep. 2012. vol 45. P. 108-113. 

Сухих А.С., Поморцева Л.С., Чистохин Ю.Г., Большаков В.В. Сравнительная оценка методов извлечения биологически активных веществ из Звездчатки средней // Медицина в Кузбассе. 2010. № 3. С. 15-17.

Код для цитирования: Скопировать