XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

В настоящее время все большее значение в лабораторной диагностике и эпидемиологическом надзоре за инфекционными заболеваниями придается молекулярногенетическим методам исследования. Особое место занимают методы, основанные на секвенировании нуклеиновых кислот (мультилокусное секвенирование (MLST), мультилокусный анализ областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA), полногеномное секвенирование), позволяющие выявить и описать генетическую структуру новых, различия в геноме уже известных инфекционных агентов, осуществлять мониторинг генетической вариабельности патогенов, их распространенности и происхождения [1].

С появлением платформ NGS открываются новые перспективы в изучении полногеномных последовательностей большого числа патогенов (например, M. tuberculosis, E. coli, H. pylori, S. aureus, V. cholerae, N. meningitides, вирусов парентеральных гепатитов, вирусов группы герпеса и т. д.), в создании информационных технологий и методов молекулярно-генетической характеристики возбудителей инфекционных заболеваний, позволяющих решать как фундаментальные, так и практические задачи микробиологии, вирусологии, эпидемиологии [2].

В зарубежной литературе широко обсуждаются возможности использования различных платформ NGS как в научных исследованиях, так и в повседневной практике лечебных учреждений для решения проблем диагностики инфекционных заболеваний с использованием метагеномного подхода [3], мониторинга мутаций, приводящих к лекарственной устойчивости вирусов и бактерий.

Основными точками приложения методов NGS в области микробиологии, вирусологии и эпидемиологии являются:

• открытие новых бактерий и вирусов с использованием метагеномных подходов;

• изучение микробных сообществ различных биотопов тела здорового человека и в состоянии болезни;

• анализ вариабельности геномов возбудителей инфекционных заболеваний.

Секвенирование нуклеиновых кислот – метод определения нуклеотидной последовательности, позволяющий получить описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров (нуклеотидов). В основе метода лежит терминирование синтеза цепи ДНК ДНК-полимеразой с помощью дидезоксирибонуклеозид трифосфатами. Полученные фрагменты ДНК разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле по величине фрагмента.

Международный проект «Геном Человека» (Human Genome Project – HGP) позволил разработать новый способ определения более длинных последовательностей ДНК, названный «shotgun-sequencing» (метод «дробовика»), при котором геномная ДНК энзиматическим или химическим способом гидролизуется на короткие фрагменты, клонируемые и используемые в дальнейшем для определения нуклеотидной последовательности методом Сэнгера. Полную последовательность исследуемого фрагмента ДНК определяют путем выравнивания и объединения полученных нуклеотидных последовательностей за счет их частичного перекрывания. Этот способ позволил впервые определить полную нуклеотидную последовательность генома человека. Метод shotgun-sequencing послужил основой для массивного параллельного секвенирования, используемого в NGS.

Массивное параллельное секвенирование или высокопроизводительное параллельное секвенирование (NGS) является новым этапом в совершенствовании технологий определения нуклеотидных последовательностей. Принципиальное отличие технологий NGS состоит в возможности параллельного определения нуклеотидных последовательностей множества различных нитей ДНК и чтения миллиардов нуклеотидов в день. На платформах NGS проводят одновременное секвенирование пулированных нуклеиновых кислот, выделенных из большого количества различных образцов. Для дифференцировки исследуемых образцов используют наборы штрих-кодов или индексов (до 96 вариантов), представляющих собой олигонуклеотиды известной последовательности [4].

Молекулярно-генетические методы занимают одно из важнейших мест в диагностике и эпидемиологическом надзоре за инфекционными заболеваниями, поскольку отличаются высокой чувствительностью, специфичностью, экспрессностью. Использование молекулярно-генетических подходов, основанных, в частности, на амплификации нуклеиновых кислот, особенно актуально и дает прекрасные результаты в случаях, когда возбудитель относится к группе труднокультивируемых или некультивируемых, а также присутствует в небольшом количестве.

Метагеномика – это один из разделов геномики, посвященный изучению всего генетического материала (метагенома) сообществ микроорганизмов, присутствующих в исследуемом образце. Объектами изучения метагеномики могут являться любые популяции микроорганизмов, обитающих в воде, почве, организме животного, человека или любой другой среде. Главной целью метагеномики является получение и анализ всех геномов для установления видового состава и метаболических взаимосвязей в сообществе.

Метагеномное исследование позволяет выявить в любом объекте не только широкий спектр бактерий, но также присутствие вирусов и простейших.

При проведении метагеномных исследований используют следующие методы:

• секвенирование фрагментов ДНК, кодирующих эволюционно консервативные гены;

• секвенирование метагеномной ДНК сообщества путем ее случайного фрагментирования (whole-metagenome shotgun sequencing).

Одним из важнейших объектов изучения метагеномики является симбиотический микробиом человека. Изучение микробиома различных биотопов тела человека позволяет дать характеристику микробиоты здоровых лиц взрослого населения, способствует пониманию взаимоотношений между микроорганизмами, поскольку микробиом человека представляет собой не просто совокупность микроорганизмов, но сложную и многокомпонентную систему с внутренней структурой, динамикой, активно взаимодействующую с организмом хозяина. Известно, что микробиота участвует в формировании иммунной системы, развитии тканей, влияет на защитные механизмы, препятствующие проникновению патогенов. Патогенез множества заболеваний прямо или косвенно связан с ферментативной и биохимической активностью микробиоты и ее влиянием на организм человека.

Основное преимущество метагеномных исследований, основанных на секвенировании суммарной ДНК/РНК исследуемого образца, заключается в возможности выявления широкого спектра микроорганизмов: бактерий, вирусов, грибов и простейших. Внедрение данного метода связано с появлением платформ NGS. Отсутствие этапа предварительной амплификации снижает процент ошибок. Общая ДНК/РНК фрагментируется ферментативно, а затем определяется нуклеотидная последовательность всех полученных фрагментов одновременно. Данный подход позволяет не только дать характеристику структуры сообщества, находящегося в образце, но также провести анализ метаболических и филогенетических взаимосвязей.

Секвенирование метагеномной ДНК/РНК также успешно применяется для характеристики микробиома человека, в частности, его вирусного компонента – вирома.

В настоящее время все большее значение придается использованию метагеномного подхода в этиологической диагностике инфекционных заболеваний. Метагеномный подход с использованием технологий NGS позволяет проводить прямую детекцию ранее неизвестных вирусов или бактерий, как патогенных, так и условнопатогенных, а также получать молекулярно-генетическую характеристику инфекционных агентов в исследуемых образцах. В работах зарубежных исследователей уже представлены данные об успешном использовании платформ NGS для выявления ранее неизвестных инфекционных агентов. Так, впервые технологии NGS были использованы при расследовании причин смерти трех лихорадящих больных, скончавшихся через несколько недель после трансплантации органов от одного донора в Австралии. Проведенные традиционные микробиологические и молекулярно-генетические исследования на широкий круг инфекционных агентов оказались неинформативными. Дальнейшее расследование данного случая проводилось с использованием платформы NGS 454 GS FLX (Life Science/Roche), позволившей выявить последовательности, принадлежавшие аренавирусам.

Дополнительный анализ установил, что возбудителем инфекции являлся новый штамм аренавируса, близкий к вирусу лимфатического хориоменингита (LCMV).

В целом использование платформ NGS для диагностики инфекционных заболеваний на настоящий момент все еще остается достаточно дорогим удовольствием, что, безусловно, является серьезным ограничением для применения их в практическом здравоохранении. Однако платформы NGS представляют собой мощный инструмент для открытия новых вирусов и бактерий. Метагеномные исследования позволяют изучать динамические изменения микробиоты при различных инфекциях, а также определить роль присутствующих совместно патогенов в развитии инфекционного заболевания. Платформы NGS могут быть использованы как для создания новых, так и для усовершенствования существующих ПЦР тест-систем, позволяющих выявить широкий спектр бактериальных и вирусных патогенов – возбудителей актуальных инфекционных заболеваний.

ЛИТЕРАТУРА

Осин А.В., Краснов Я.М., Гусева Н.П. и др. Разработка алгоритма MLSTтипирования пандемических и предпандемических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор. Проблемы особо опасных инфекций. 2011. Т. 107. № 1. С. 58-61.

Мокроусов И.В. Методологические подходы к генотипированию Mycobacterium tuberculosis для эволюционных и эпидемиологических исследований. Инфекция и иммунитет. 2012. Т. 2. № 3. С. 603-614.

Palacios G., Hornig M., Cisterna D. et al. Streptococcus pneumoniae coinfection is correlated with the severity of H1N1 pandemic influenza. PLoS ONE. 2009. Vol. 4. № 12. P. 1-5

Pettersson E., J. Lundeberg, A. Ahmadian. Generations of sequencing technologies. Genomics. 2009. Vol. 93. № 2. Р. 105–111.

Код для цитирования: Скопировать