XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

Актуальность. На современном этапе всё большую актуальность приобретают исследования, направленные на выявление механизмов нейродегенеративных процессов с целью поиска методов профилактики таких патологических состояний, как когнитивные расстройства, болезнь Альцгеймера и Паркинсона. Разработка стратегии лечения на фундаментальной платформе клеточных технологий диктует поиск ниш стволовых клеток в дефинитивном организме, что невозможно выполнить без знаний механизмов эмбрионального развития, дифференцировки и специализации нервной ткани, начиная с периода закладки нервной трубки. Это определило направление нашего исследования.

Целью нашего исследования явилось изучение особенностей строения и развития нервной трубки в эмбриональный период.

Материал и методы. С разрешения Этического комитета ДВФУ, в соответствии с Хельсинской декларацией, по клиническим показаниям и с информированного согласия пациентов производили забор биоптатов мозга эмбрионов человека в возрасте от 3-х недель до девяти. Иммуногистохимическими методами выявляли GFAP и S100 - позитивные клетки, проанализировали их количественные соотношения, и выявили особенности их топографического распределения в развивающейся нервной трубке. Анализ результатов проведён с помощью микроскопа Olympus BX51, иллюстрации получены с помощью цифровой камеры DP 25, статистическая обработка исследуемого материала произведена с помощью фирменных компьютерных программ фирмы Olympus. Для изучения морфологии развивающегося мозга (СМ и ГМ) материал помещали в раствор (предоставленный из Японии) на 2–3 дня для фиксации. Время фиксации определяли в зависимости от размеров биоптатов. После промывки в проточной воде в течение 1 часа материал погружали на 5 минут в сменяющиеся порции дистиллированной воды, а затем обезвоживали в батарее спиртов от 50^о до 96^о. Заливка в парафин проводилась по классической методике. Время каждого этапа заливки определяли в зависимости от размеров биоптата.

Материал заливали в парафин по классической схеме через проводку смеси ксилола и парафина с нарастающим содержанием парафина с последующим приготовлением срезов. Из залитого в парафин материала готовили срезы толщиной не более 5–10 мкм и помещали сразу на предметные стекла, обработанные яичным белком. Парафиновые срезы депарафинировали в сменяющихся порциях ксилола. На срезы наносили гематоксилин на 10–15 минут, быстро промывали дистиллированной водой и наносили раствор эозина на 1 минуту. Очень быстро ополаскивали дистиллированной водой и проводили через 96–градусный спирт, а затем просветляли в ксилоле в течение 3–5 минут, заключали в бальзам под покровное стекло.Все статистические данные получены с помощью компьютерного программного обеспечения микроскопа Olympus BX51 и цифровой камеры CD25 фирмы Olympus.

Результаты исследования и их обсуждение. В течение третьей недели после оплодотворения человеческий эмбрион проходит гаструляцию — комплексный процесс инволюции и перераспределения клеток, что приводит к формированию трех первоначальных эмбриональных зародышевых листков: (1) эктодермы, (2) мезодермы и (3) энтодермы.

Мезодерма (мезобласт) — средний зародышевый листок, который располагается между экто- и энтодермой. Идентифицируются 3 части: склеротом — зачаток для развития костной и хрящевой ткани осевого скелета, миотом – зачаток будущей поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани, и дерматом — зачаток дермы - соединительнотканной основы кожи. Нами отмечено, что в этот период склеротом имеет 3-х слойное строение. Слой, прилежащий к миотому, представлен крупными клетками, с ярко базофильными ядрами, густо расположенными 7-10 слоями клеток. Выстилка энтодермального слоя представлена плоскими клетками, с вытянутыми ядрами. Между наружным и внутренним слоем располагается средний слой, в котором выявляются отростчатые клетки, по морфологическим признакам подобные мезенхимоцитам. Миотом со стороны склеротома вдается в наружный слой склеротома, а выступающие пирамидки густоклеточного слоя склеротома направлены в углубления, формируемые эктодермой, вдающейся в дерматом.

Нейруляция характеризуется тем, что сразу после гаструляции эктодерма подразделяется на нейроэктодерму и презумптивный эпидермис.

После нейруляции образуются нервная трубка и две ганглиозные пластинки. Из туловищного отдела нервной трубки развивается спинной мозг, из краниального — головной мозг. Из ганглиозных пластинок образуются спинномозговые, симпатические и интрамуральные узлы, а также хромаффинная ткань надпочечников, параганглиев и нейроэндокринные клетки APUD-серии. Параллельно с развитием головного и спинного мозга происходит формирование спинномозговых и периферических вегетативных ганглиев, где также дифференцируются нейроны и клетки глии.

Источником развития спинного мозга является туловищный отдел нервной трубки. Кроме того, в развитии органа принимает участие мезенхима. Эмбриональная нервная трубка, вначале состоящая из одного слоя призматических клеток, становится вскоре многослойной благодаря интенсивному митотическому делению клеток (медуллобластов, или матричных клеток). В результате митозов и дивергентной дифференцировки матричные клетки превращаются в нейробласты, глиобласты (спонгиобласты) и эпендимобласты. Вскоре в стенке нервной трубки формируются три слоя: эпендимный, плащевой и краевая вуаль. Внутренний — эпендимный — слой, образует выстилку центрального канала спинного мозга. Плащевой слой образован нейробластами и глиобластами, которые мигрировали из эпендимного слоя.

Из клеток плащевого слоя в дальнейшем образуется серое вещество спинного мозга. Нейробласты в плащевом слое митозом уже не делятся. Они дифференцируются, образуя отростки, в нейроны. Глиобласты, выселяясь в толщу плащевого слоя, сохраняют способность делиться митозом. Из отростков нервных клеток и глиобластов формируется наружный слой нервной трубки — краевая вуаль. Позднее этот слой образует белое вещество спинного мозга. Дифференцировка нейронов спинного мозга происходит гетерохронно. Первыми развиваются двигательные (моторные) нейроны передних рогов спинного мозга, затем ассоциативные (комиссуральные, канатиковые, пучковые) и последними — нейроны студенистого (роландова) вещества, а также клетки Реншоу (тормозные нейроны в передних рогах спинного мозга). Наряду с дифференцировкой нейронов в гистогенезе спинного мозга устанавливаются связи между нервными клетками, а также между нейронами и исполнительными структурами в составе формирующихся рефлекторных дуг. Отсутствие межклеточных контактов у части нейронов является одной из причин массовой их гибели по механизму апоптоза. Процесс межклеточной интеграции сопровождается образованием клеточных скоплений, называемых ядрами. Образующие их нейроны имеют ветвящиеся дендриты, тогда как нейриты (аксоны) объединяются в компактные пучки. В процессе развития аксоны двигательных нейронов выходят из спинного мозга, образуя передние корешки, и направляются в закладки скелетных мышц. Задние рога формируются центральными отростками чувствительных нейронов спинномозговых ганглиев, которые вступают во взаимодействия с нейронами серого вещества спинного мозга. Миелинизация отростков нейронов начинается с 4-го месяца эмбриогенеза и продолжается после рождения. При этом глиобласты (спонгиобласты) дифференцируются на астроциты и олигодендроциты. Развитие спинного мозга тесно связано с процессом межнейронной интеграции с нейронами головного мозга. Мезенхима формирует ткани мозговых оболочек, кровеносные сосуды.

В процессе нейруляции белое вещество в СМ развивается снаружи. Спинномозговой канал (СМК) и зона дорсального смыкания нервной трубки (ДСНТ) имеют неодинаковую ширину просвета. Центральная часть СМК в верхнем отделе туловища зародыша более чем в два раза превышает просвет ДСНТ. Нервный гребень ближе к головному концу нервной трубки выражен лучше.

Эпендимная зона в дорсальной части СМ на границе с нервным гребнем истончается, граница с мантийной зоной неровная, образует пирамидки, вдающиеся в мантийную зону, а между пирамидками нервного гребня мантийный слой вдаётся в эпендимную зону. Задние рога на этом этапе развития СМ не идентифицируются, весь задний полюс имеет на срезе форму круга. Краевая вуаль – зачаток белого вещества СМ содержит немногочисленные клетки.

Отмечено, что нервный гребень и его клеточный ансамбль начинает формироваться до замыкания в дорсальной части нервной трубки, в то время как вентральная часть нервной трубки имеет эпендимный, мантийный слои и краевую вуаль. Яркая базофилия соответствует эпендимной зоне вокруг спиномозгового канала и области формирования нервного гребня. Вокруг формирующегося спинного мозга (СМ) формируется полость, заполненная жидкостью, наружные стенки которой образованы трёхслойной оболочкой. Внутренний представлен слоем плоских клеток, затем следует волокнистый слой, покрытый одним слоем наружных клеток.

Эпендимный слой ограничен от спинномозгового канала чётко идентифицирующейся мембраной, окрашенной в розовый цвет. Выстилка представлена двумя типами клеток, хромофильными и хромофобными с базофильными ядрами и неокрашенной цитоплазмой. Пронизывают весь эпендимный слой, поэтому напоминают мюллеровскую глию. Мантийный слой образует передние тупые рога, центрально располагаются мелкие клетки, на периферии мантийной зоны клетки более редко располагаются и имеют более крупные размеры. Эпендимный слой в вентральной части равномерный, на переднем полюсе имеет более рыхлое расположение клеток. На поперечном срезе переднего полюса туловищного отдела эмбриона человека идентифицируются передний рог серого вещества, белое вещество СМ, формирующиеся зачатки ребер с латеральной стороны.