XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

Актуальность и практическая значимость работы. Бешенство - широко распространённое вирусное заболевание животных, которое вызывает нейротропный вирус рода Lyssavirus в семействе Rhabdoviridae, отряд Mononegavirales. В пределах рода выделяют двенадцать генотипов [1]. Наибольший интерес вызывает вирус классического бешенства (RABV). В настоящее время бешенство регистрируется на территории более 80 стран мира. Классическое бешенство не регистрируется в Японии, Новой Зеландии, на Гавайях, а также в Австралии и Антарктике [2, 3, 4]. Особенно сложная ситуация в Африке, Азии и Латинской Америке, где регистрируют городской тип бешенства.

Страны неблагополучные по бешенству несут значительный экономический ущерб, который складывается из потерь от гибели животных, затрат на отлов бродячих животных, карантинные мероприятия, уничтожение больных и подозреваемых в заражении бешенством животных, а так же затрат на проведение антирабической вакцинации, регулирование численности диких и бродячих животных и диагностические исследования.

Бешенство известно людям более 3000 лет, но справиться с этим зооантропонозом человечество так и не смогло. До настоящего времени от этой болезни в мире ежегодно погибает 35-55 тыс. человек и более 1 млн. животных. Не менее 4 млн. человек получают антирабическое лечение. Затраты только на вакцинацию животных в РФ ежегодно составляют более 16 млн. руб., а общий ущерб исчисляется сотнями миллионов [5].

Особенности эпизоотического и эпидемического процессов бешенства изучены [6, 7, 8, 9, 10]. Этими исследователями и их научными школами выявлены многие закономерности эпизоотического процесса и разработан комплекс профилактических мероприятий, способствующий сокращению заболеваемости людей. Однако это достижение поддерживается только благодаря постоянным усилиям санитарной и ветеринарной служб, поскольку уровень заболеваемости животных продолжает оставаться высоким и обусловливается активностью природных очагов [11, 12]. За истекшие полтора десятилетия выявленные закономерности эпизоотического процесса во многом подтвердились. Но время выдвинуло дополнительные вопросы и поставило новые задачи, относительно современных экологических особенностей проявления эпизоотического процесса в природных очагах бешенства.

На современном этапе борьба с бешенством включает уничтожение бродячих собак, снижение плотности популяции диких животных - переносчиков и резервуаров вируса бешенства, а также вакцинации восприимчивых животных.

Для предупреждения распространения бешенства и немедленной ликвидации выявляемых очагов этого опасного зооноза ветеринарная служба страны ежегодно проводит плановую профилактическую вакцинацию домашних и сельскохозяйственных животных инактивированной культуральной антирабической вакциной.

Наиболее эффективным способом борьбы с бешенством является ликвидация очагов этой инфекции в популяции лисиц и других плотоядных. Наряду со снижением численности популяции до уровня ниже критического, практически действенным способом профилактики бешенства среди диких животных является их иммунизация [13].

Таким образом, борьба с бешенством слагается из выявления источника возбудителя болезни, уничтожения возбудителя во внешней среде, резервуаром которого могут быть как плотоядные, так и грызуны, предохранения от заболевания здоровых животных путем проведения профилактических мероприятий.

Ныне существуют лабораторные методы диагностики, которые слагаются из патоморфологического исследования ткани головного мозга на обнаружение телец Бабеша-Негри; в выявлении антигена вируса бешенства методами РИФ и РП; и проведении биопробы на белых мышах.

Однако, несмотря на давнюю известность этого заболевания, оно продолжает наносить существенный урон животноводству, а проблемы борьбы с бешенством актуальны как для ветеринарии, так и для медицины.

Материал и методы исследований. РаботапроводиласьвУйгурском районном филиале «Республиканская ветеринарная лаборатория» и в Научно-производственном предприятие «Антиген».

Результаты собственных исследований. Иммуноглобулин диагностический антирабический преципитирующий (ИДАП) получали путем иммунизации продуцентов антигеном, приготовленным из фиксированного вируса бешенства штамма «овечий» ВГНКИ, с последующим забором у них крови, отделением сыворотки, выделения иммуноглобулина, консервированием, фасовкой и высушиванием.

Метод диффузной преципитации (РДП) основан на свойстве гомологичных антигена и антител при диффузии в агаровый гель образовывать комплекс антиген-антитело, которой визуально наблюдается в виде линии преципитата

Специфичность метода РДП, как диагностического теста при бешенстве всецело зависит от специфичности и активности преципитирующих антител-иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего (ИДАП).

Схема технологического процесса производства иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего (ИДАП)

1 стадия. Получение высокоактивной моноспецифической гиперимунной антирабической сыворотки.

стадия. Выделение иммуноглобулинов из сыворотки.

стадия. Испытание препарата ИДАП на активность и моноспецифичность.

стадия. Составление серии, расфасовка и сублимационная сушка иммуноглобулина.

стадия. Контроль качества сухого препарата ИДАП.

стадия. Приготовление антигена контрольного положительного (АКП);

стадия. Приготовление антигена контрольного отрицательного (АКО);

стадия. Приготовление агарового геля;

Маркировка, упаковка, хранение, транспортировка.

Получение высокоактивной моноспецифической гиперимунной антирабической сыворотки.

Для получения антирабической сыворотки необходим фиксированный вирус бешенства штамм «овечий» ГНКИ, который пассируется 1-2 раза в год на кроликах, морских свинках или мышах и в качестве расплодки используется по мере надобности.

Вируссодержащий мозг в стерильных условиях разрезается на кусочки массой 0,5-1,5 г, которые полностью погружаются в стерильный 50% глицерин (ГОСТ 6259-75) на фосфатном буфере рН 7,2-7,4 или физиологическом растворе в колбах и хранится в холодильнике при минус 8-20С°.

Контроль биологических, вирулентных и патологических свойств вируса проводят тестами РДП, МФА.

Получение иммунизационного антигена.

Гипериммунизационный антиген готовят из вирулентного мозга осленка (жеребенка), зараженного интрацеребрально в дозе 0,2-0,3 см³ фиксированным вирусом бешенства. Заболевшее животное в агональном состоянии умерщвляют обескровливанием (5-7 суток), извлекают головной мозг в асептических условиях и хранят в стеклянной посуде в стерильном 50% глицерине на физиологическом растворе хлорида натрия при температуре минус 8-20С°. По мере надобности из него в течение 6-ти месяцев готовят гипериммунизационный антиген.

Исходный мозг и приготовляемый антиген должны быть бактериально стерильны: проверка на стерильность выполняется высевами из мозга и антигена на МПБ, МПА и среду Китт-Тароци и выдержки посевов в термостате при температуре 37С° в течение 7 дней.

Иммунизационный антиген готовится в стерильных условиях и представляет собой 4%-ную суспензию головного мозга осленка (жеребенка) на физиологическом растворе. Применяется в двух вариантах:

№ 1 (фенольного) - с добавлением 0,25 % фенола;

№ 2 (адъювантно-депонированного) – с добавлением 20% гидрата окиси алюминия по ГОСТ 11841-76 и 0,05% сапонина к общему объему. Этот вариант антигена содержит в своем составе антибиотики из расчета 1000 ЕД пенициллина и 500 мг стептомицина на 1 см³. (рисунки 1,2,3).

Рисунок 1. Взятие мозга у зараженной мыши

Рисунок 2. Взятие мозга у зараженной мыши

Рисунок 3. Антиген для гипериммунизации продуцентов

Подбор продуцентов.В качестве продуцентов гиперимунной антирабической сыворотки используются ослы (лошади) местной породы, живой массой 150-170 кг (350-400 кг).

Гипериммунизация продуцентов.Гипериммунизацию животных осуществляют подкожными инъекциями фенольного антигена и внутримышечными в 2-3 места адъювантно-депонированного антигена в подлопаточную область, бедро и шею.

В начале всех ослов (лошадей) иммунизируют адъювантно-депонированным антигеном в дозе 5 см³, а через 2 недели – фенольным в той же дозе.

Через месяц от начала иммунизации вводятся оба антигена при той же дозе антигена № 2 и удвоенной дозе фенольного антигена.

В течение следующих 2-х месяцев доза адъювантно-депонированного антигена будет оставаться постоянной, а фенольного будет увеличиваться вдвое. При этом стимулирующие инъекции антигеном № 1 в середине месяца будут постоянными – 5 см³.

Нарастание титров антител проверяют по сывороткам проб крови, взятых в стерильные пробирки перед каждой инъекцией любого антигена. Сыворотку исследуют индивидуально от каждого животного на преципитирующую активность реакцией преципитации в агаровом геле.

При достижении преципитационного титра по РДП 1:32-1:128 сыворотки объединяют и определяют вируснейтрализующую активность методом титрации на белых мышах. Она должна быть в пределах 500-2000 ЕР.

Животные, имеющие преципитационный титр ниже 1:32 выбраковываются, а остальные эксплуатируются как продуценты и гипериммунизируются по производственной схеме.

Получение сыворотки.Забор крови от каждого осла (лошади) осуществляют из яремной вены с помощью специально смонтированного стерильного монтажа. Он состоит из кровобрательной иглы диаметром 5 см³ и подсоединенного к ней резинового шланга длиной 100-120 см и диаметром 1 см. Через стеклянную трубку в ватно-марлевой пробке шланг соединен со стеклянным 3000-5000 см³ баллоном, содержащим 50 см³ физиологического раствора.

Кровь от животных берут утром натощак, а потом их обязательно поят.

Для отсоса сыворотки из емкости с кровью через ту же пробку вмонтируется стеклянная трубка и резиновый шланг диаметром 0,5 см, который позднее соединяется со стерильной емкостью для сбора сыворотки.

Сыворотку получают методом отстоя в условиях холодильника. С соблюдением асептики в течение 2 дней сыворотку сливают в баллон-приемник. В нем же еще 2 суток отстаивают форменные элементы, попадающие в незначительном количестве и уже совершенно прозрачную сыворотку сифоном сливают в бутыль для использования по назначению (рисунок 4).

Рисунок 4. Взятая кровь у продуцентов

Контроль сыворотки на активность.Антирабические сыворотки после каждого крововзятия индивидуально от каждого животного контролируют на преципитирующую активность. РДП ставится в разведениях сывороток от цельного до 1:128 с контрольным положительным антигеном (головной мозг щенят, осленка (жеребенка), белых мышей, павших от интрацеребрального заражения фиксированным вирусом бешенства) и контрольным отрицательным антигеном (головной мозг здоровых невакцинированных против бешенства животных – щенка, осленка (жеребенка) и др.).

Выделение иммуноглобулинов из сыворотки.

Иммуноглобулин выделяют спиртовым методом из высокоактивной без следов гемолиза антирабической сыворотки. Для осаждения глобулинов используют раствор 53°-ного этилового спирта по ГОСТ 5962-67.

Для освобождения от термолабильных ингибиторов сыворотка прогревается в малообъемной стеклянной посуде 1000-3000 см³ в водяной бане 30 минут при температуре 56-58С°.

В сыворотке измеряют рН, которая должна быть равна 7,0-7,2 (измерение на потенциометре-иономере), охлаждают до 0С° и, одновременно, охлаждают предназначенный для осаждения 53°-ный спирт до минус 15-20С°. В условиях холодильной камеры к охлажденной сыворотке медленно, при постоянном перемешивании (электромешалка с гибким валом) добавляют равный объем охлажденного спирта. Смесь сыворотки со спиртом продолжают перемешивать 30 минут и выдерживают 16-18 часов для формирования осадка.

Прозрачную надосадочную жидкость осторожно сливают и удаляют. Выпавшие в осадок иммуноглобулины отделяют от некоторого количества надосадочной жидкости центрифугированием в рефрижераторной центрифуге в течение 30 минут при 4000 об/мин.

Осадок глобулина растворяют в охлажденном 0,15М растворе хлорида натрия, постепенно повышая температуру до комнатной. Концентрацию белка в растворе устанавливают в пределах 7-8% (контроль рефрактометром). Удаление незначительного количества спирта в растворе иммуноглобулина достигается его диализом против 0,15 М раствора хлорида натрия.

Иммуноглобулин по фракционному составу состоит, в основном, из гамма-глобулина с примесью незначительного количества бета-глобулина.

Порядок применения иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего (ИДАП) для диагностики бешенства методом реакции диффузной преципитации

Иммуноглобулин диагностический антирабический преципитирующий предназначается для диагностики бешенства реакцией диффузной преципитации (РДП) в агаровом геле. Он позволяет обнаруживать рабический антиген в различном патологическом материале, в частности, в головном мозге. Метод диффузной преципитации (РДП) основан на том, что гомологичные антиген и антитела, помещение в агаровый гель, диффундируют и образуют три встрече преципитат в виде белых линий. РДП при диагностики бешенства применяют для обнаружения специфического рабического антигена в мозге животных, павших от уличного бешенства или при экспериментальном заражений различными штаммами вируса-фикс. РДП является экспрессным методом, позволяющим ставит диагноз по первичному патологическому материалу от павших животных в течение суток. Исследованию подлежит как свежий, так и загнивший головной мозг. Нервная ткань, консервированная глицерином, формалином, ацетоном и спиртом не пригодна для постановки РДП (рисунок 5).

Рисунок 5. Набор для диагностики бешенства в РДП

Иммуноглобулин диагностический антирабический преципитирующий представляет собой пористую однородную массу желтоватого цвета

Иммуноглобулин диагностический антирабический преципитирующий выпускают в ампулах, которые должны быть упакованы в картонные коробки с разделительными перегородками. На каждой ампуле с иммуноглобулином должно быть указано: наименование препарата и его объем во флаконе (см³), номер серии, номер контроля, дата изготовления, срок годности.

На каждой коробке должно быть указано: наименование и товарный знак предприятия-изготовителя, наименование препарата и его объем во флаконе (см³), номер серии, номер контроля, дата изготовления, срок годности, условия хранения, объем препарата в одном флаконе см³.

В каждую коробку должно быть вложено наставление по применению иммуноглобулина.

Перед применением каждую ампулу с иммуноглобулином просматри­вают.

Ампулы с препаратом без этикеток (без надписи), с трещи­нами, содержащие постороннюю примесь, а также иммуноглобулин с истекшим сроком годности выбраковывают.

Для выполнения РДП на бешенство необходимо иметь:

агаровый гель;

иммуноглобулин диагностический антирабический преципитирующий (ИДАП);

антиген контрольный положительный (АКП);

антиген контрольный отрицательный (АКО);

ИДАП представляет собой высушенную лиофильным способом глобулиновую фракцию антирабической сыворотки ослов или лошадей. Перед употреблением готовят исходный раствор глобулина и используют для постановки реакции в разведениях указанных в п. 2.7 наставления.

АКП предназначен для проверки специфичности РДП. Антиген представляет собой гомогенизированный и консервированный мертиолатом головной мозг щенят, павших после интрацеребрального заражения вирусом-фикс.

АКО используют в качестве отрицательного контроля для реакции и приготовлен он аналогично АКП из мозга здоровых щенят.

На обезжиренное, слегка подогретое (над пламенем) предметное стекло наносят каплю расплавленного агара, делают мазок (наподобие мазка крови) и на застывший агар наливают сверху еще 2,5 мл среды, которую равномерно распределяют по поверхности стекла слоем, толщиной приблизительно 2 мм. Затем стекла после застывания агара, попарно вносят в чашки Петри, куда с двух сторон помещают кусочки смоченной водой ваты. Стекла с агаром используют в течения 7 дней после приготовления.

Лунки в агаре пробивают с помощью тонкостенной металлической трубочки с внутренним диаметром 4-5 мм, располагая их согласно трафарету. Необходимо следить, чтобы не было отслаивания агарового геля от стекла, так как в этом случае антиген и антитела подтекают под слой агара и линии преципитации могут не образоваться.

При исследовании головного мозга крупного рогатого стока, овец, лошадей, верблюдов, собак, лисиц, кроликов и т.д., необходимо проверят в реакции следующие отделы мозга : кору полушарий – левой и правой сторон (А,Б), аммоновы рога – левый и правый (С,Д), мозжечок (Е) и продолговатый мозг (Ж)

Исследуя мозг мелких животных (крысы, суслики, морские свинки, хомяки и т.д.), рекомендуется проверять в реакции три каких-либо отдела или весь головной мозг.

Через 15-20 минут после заполнения лунок мозгом пастообразной консистенции луночки, обозначенные цифрами 1, 2, 3, 4 заполняют преципитирующим глобулином (2-3 капли) в разведениях 1:2; 1:4; 1:8; 1:16 (от исходного разведения) на физиологическом растворе.

Контроли с положительными и отрицательными антигенами ставится одновременно, в том же агаре, по тому же трафарету. При этом достаточно две лунки заполнить положительным и отрицательным антигенами, а лунки вокруг – глобулином в указанных разведениях.

Через 15-20 минут после постановки реакции чашки Петри с предметными стеклами ставят в термостат на ночь при температуре 37⁰С, затем чашки оставляют при комнатной температуре до истечения 24 часов (рисунок 6).

Рисунок 6. Постановка РДП

Учет реакции проводят через 3,6 и 24 часа после постановки. Иногда положительная реакция отмечается уже через 2,5-3 часа (+) и соответствует образованию одной и реже двух линии преципитации. Окончательную реакцию учитывают через 24 часа.

Линии преципитации могут образовываться вокруг лунки с антигеном со всеми разведениями глобулина и не редко с исследуемым материалом из всех отделов мозга, в других случаях реакция бывает положительной с материалом только из некоторых отделов мозга и с отдельными разведениями глобулина. Для постановки положительного диагноза достаточно образование линии преципитации с материалом из одного отдела головного мозга с одним разведением глобулина Образовавшиеся линии преципитации видимы визуально при просвечивании стекол осветителем снизу вверх под углом, приблизительно 45⁰. При положительной реакции преципитации в прозрачном агаре между лунками с глобулином и антигеном могут образоваться одна, две и очень редко три параллельно расположенные линии преципитации.

При отрицательных показаниях реакции преципитации проводят биопробу на 5-10 белых мышах или двух морских свинках путем интрацеребрального их заражения. Наблюдения за зараженными животными ведут не менее 1,5 месяцев. Павших после заражения животных обследуют с помощью РДП, и в зависимости от его показании ставят окончательный диагноз. Проверка диагностической ценности глобулина антирабического преципитирующего (ГАП) полученного по разным методикам

Исследовали лиофилизированные образцы микросерии ГАП двух вариантов, полученные из ослиной гипериммунной сыворотки в 2010 году методом спиртового фракционирования -– ГАПс и осаждением полдиэтиленгликолем (ПЭГ-6000) – ГАПп.

Образцы лиофилизированных ГАП растворяли в дистиллированной воде и делали разведение на физиологическом растворе от 1:2 до 1:128. Лунки в агаровом геле заполняли разведениями и цельным глобулином. Учет реакции проводили через 24 часа. Результаты выявления рабического вируса с использованием штаммов уличного бешенства представлены в таблице 1.

Таблица - 1. Результаты титрации ГАПс и ИДАП

Штамм вируса бешенства	Разведения глобулинов
	ц	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128
Штамм фикс	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++	-
Контроль Нормальный мозг	-	-	-	-	-	-	-	-

Как видно из таблицы 1, полученный иммуноглобулин имел достаточно высокий преципитационный титр, соответственно 1:32 по тесту РДП в агаровом геле с антигеном, изготовленным из головного мозга животных, зараженным вирусом фикс, штамм овечий.

Заключение. В лабораторных условиях изучены методы диагностики бешенства. Изучена технология получения набора для диагностики бешенства в РДП. Предложены мероприятия по совершенствованию ветеринарных мероприятий при бешенстве животных.

Практическая значимость. Предложено проведение строгого учета собак путем их паспортизации, снижение популяции бездомных собак путем их отлова, и диких плотоядных путем их отстрела, проведение вакцинации собак против бешенства, соблюдение правил содержания животных, проведение разъяснительной работы среди населения, дезинфекцию животноводческих объектов.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1 International Committe on Taxonomy of Viruses [electronic resource]. - URL: http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp. - 13.11.2013.

2 Fisher, Christine R.; Streicker, Daniel G.; Schnell, Matthias J. The spread and evolution of rabies virus: conquering new frontiers. Nature reviews microbiology. Том: 16. Выпуск: 4. Стр.: 241-255. Опубликовано: APR 2018

3 Chen, Jingfang; Liu, Guang; Jin, Tao; и др. Epidemiological and Genetic Characteristics of Rabies Virus Transmitted Through Organ Transplantation. Frontiers in cellular and infection microbiology. Том: 8. № 86. MAR 27 2018

4 Макаров В.В. Актуальные проблемы бешенства: природная очаговость, методология исследования и контроля в центре России/В.В.Макаров, А. А.Воробьев// Ветеринарная патология. 2004. - № 3 (10). - С. 102-116.

5 Авилов, В.М. Эпизоотическое состояние и эффективность проводимых мероприятий против бешенства животных в России / В.М.Авилов, А.А.Гусев, А.В.Савин // Ветеринария. 2002. - № 6 - С. 3 - 6.

6 Груздев, К.Н. Бешенство животных / К.Н. Груздев, В.В. Недосеков. - М.: Аквариум, 2001. - 304 с.

7 Апалькин, В.А. Бешенство животных в России. Особенности современной эпизоотической обстановки / В.А.Апалькин, В.А.Ведерников, И.В.Балдина, Н.А.Яременко, А.М.Гулюкин, А.А.Харькевич, С.А.Коломыцев, А.А.Шабейкина//Ветеринария. 2004. - №12. - С.3-8.

8 Сидоров, Г. Н. Бешенство животных и человека в России во второй половине XX начале XXI веков / Г. Н. Сидоров, Д. Г. Сидорова // Актуальные проблемы микробиологии и инфекционной патологии животных : материалы Всерос. конф. - Омск, 2004. - С. 425-438.

9 Абдрахманов С.К., Сытник И.И., Турсункулов Ш.Ж. Визуализация и анализ ветеринарно-географического распространения бешенства с использованием ГИС-технологий // Мат. V Международная науч.-практ. конф. (17-18 марта 2010 г.). -Барнаул: Изд-во АГАУ, 2010. - Кн. 3. - С. 283-286.

10 Батанова Ж.М., Ахметсадыков Н.Н. Диагностика бешенства в РК с использованием отечественных диагностических препаратов // 2016. – №1. – С.12-20.

11 Гулюкин, А.М. Эпизоотологический мониторинг и совершенствование серологического контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства: дис. ... канд. биол. наук / А.М. Гулюкин. - Казань, 2011. - 216 с.

12 Wang, Xingtai; Werner, Barbara G.; Konomi, Raimond; идр. Animal rabies in massachusetts, 1985-2006. Journal of wildlife diseases. Том: 45. Выпуск: 2. Стр.: 375-387. Опубликовано: APR 2009

13 Papatheodorou, Dimos P.; Tasioudi, Konstantia E.; Korou, Laskarina-Maria; и др. First four Oral Rabies Vaccination campaigns of the red foxes in Greece: Evaluating factors and assessment. Veterinary microbiology Том: 216 Стр.: 107-118 Опубликовано: MAR 2018

Код для цитирования: Скопировать