XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

Спинальная мышечная атрофия (СМА) – это разновидность заболеваний, которая может привести к смерти. Заболевание наследственное и может проявиться как в раннем возрасте, так и в более позднем, примерно в период 20-30 лет. Заболевание нервно – мышечное делят на четыре типа, которые разделяют не только по возрастам (возраст пациента, в котором обнаружена болезнь), но и в зависимости от сложности.

У всех четырех типов идет изменение гена SMN, ген располагается на хромосоме 5q 13 в части повтора, где есть ген – копия SMNc. Норма копий для SMNc от нуля до шести.

Обычную диагностику СМА определяют инфекцией частиц седьмого или восьмого гена SMNt. Но данный способ не способен определить все изменения в гене, однако помогает указать на точное число копий гена SMN. Стоит указать на то, что метод определяет не число генов, а пропорцию числа центромерных и теломерных копий гена SMN. Это не дает полной картины, так как это может указывать и на рост копий гена SMNc, и на снижение копий гена SMNt.

Получается так, что нельзя предоставить диагностику, где будет 100% гарантия в диагнозе, нельзя сказать уверенно, что привело к мутации.

Создание методов количественного анализа числа генов SMNt и SMNc поможет выявить гетерозиготного носительства для пар супружеских.

Есть 2 момента, которые помогут определить статус носителя заболевания. Доказано, что в двух процентах случаев СМА это итог изменений de novo, и количество генов SMNt способно отличаться на одной хромосоме.

Ситуация иногда складывается так, что при присутствии двух копий гена SMNt может быть снижен риск носителя заболевания. В тоже время нужно не забывать о том, что там, где нет точного выявленного гена SMNt риск все же остается высоким.

Для определения количественного анализа числа копий генов SMN есть несколько способов, которые основаны на полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Количественная конкурентная для выявления SMNt и SMNc. Метод предполагает внутренний контроль для исследуемой, так и для референсной последовательностей.

Была сделана мультиплексная ПЦР, где было одновременно осуществлены амплификация фрагментов последовательности генов SMNt и SMNc, и внутреннего стандарта. Затем было проведено ограничение части гена SMNc, и оценка каждого продукта ПЦР.

Этот метод сложен, так как для него нужны радиоактивные вещества. Этот метод для обычных лабораторий не подходит, и даже опасен. Есть другие методы, которые не радиоактивные Light Cycler è TaqMan.

Методы количественной оценки имею основу ПЦР в реальном времени. Способ более легкий, но есть ряд недостатков – большой процент погрешности, а также нельзя одновременно анализировать множество частей.

Но есть метод, который не имеет такие недостатки –MLPA. MLPA очень точный, и может различать генотипы SMNt и SMNc. Основой метода служит способность восстанавливать фосфодиэтидные связи.

ПЦР проводится с универсальной парой праймеров, одна пара помечена флюоресцентной меткой. Разделение происходит капиллярным электрофорезом. Метод анализируется при помощи программы Coffa lyser.

MLPA для количественной диагностики СМА: денатуризация и гибридизация; лигазная реакция; ПЦР с универсальными праймерами X и Y; фрагментарный анализ; анализ полученных данных.

Методы, которые были описаны сосредоточены на количественной диагностики СМА, где выявляются копии гена SMNt и псевдогена SMNc. Можно сделать вывод, что методы не совершенны. Предположительно есть 3 гена локуса СМА, которые влияют на тяжесть болезни - NAIP, SERF1A(H4F5) и GTF2H2.

Согласно исследованиям количественной оценки генов локуса СМА методом MLPA были получены результаты, а которых пойдет речь далее.

K. Tomaszewicz со своими соавторами оценивали число копий SMNt и SMNc у 20 пациентов больных СМА. У 6 детей нашли делецию гена SMNt в гомозиготном состоянии, у родителей нашли по одной копии гена SMNt. Результаты подтвердились количественными ПЦР методами.

E.L. Arkblad вместе с соавторами утвердили предыдущие исследования, но и даже нашли новый вид мутации. В совершенно разных семьях была найдена протяженная делеция экзонов 1-6 генов SMNt, которую не мог обнаружить рутинный метод. Эту мутацию стали считать эффектом основателя. Зарегистрировали новую точковую мутацию, у больного с одной копией гена SMNt.

Работа E. Zapletalova с соавторами была настроена на детектирование точковых мутаций у больных СМА. Метод MLPA помог найти пациентов с одной копией генов SMNt.

В этом же 2007 году уже китайские ученые подтвердили ранее проведенные исследования. Подтвердили то, что больные с особо протяженными делециями, захватывающие гены NAIP и GTF2H2, носят особо тяжелый генотип.

Но не зависимо от того, что метод MLPA действительно имеет ряд преимуществ, он не способствует решению проблемы, тех двух процентов больных, у которых генотип с двумя копиями генов SMNt. Помимо этого присутствие полиморфизмов влияют на результаты MLPA. Они способны предотвратить гибридизацию проб, так как нет сигнала, и это может быть расценено как делеция.

Проанализировав данные можно с уверенностью сказать, что нужно разрабатывать и вводить в практику количественного метода ДНК-анализа, которые позволят определить число генов 5q13, которые вносят свою лепту в тяжесть клинических проявлений СМАI-IV типа.

Код для цитирования: Скопировать