XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

Алкилоксибензолы (АОБ) – природныесоединения, синтезируемыемикроорганизмамиразличныхтаксономическихгрупп. АОБ представлены смесью гомологов и различаются гидрофобностью и полярностью молекулы. Их главная биологическая роль – регуляция обменных процессов клетки: в зависимости от структуры гомолога и его концентраций они могут стимулировать процессы прорастания покоящихся форм или напротив ингибировать метаболическую активность и индуцировать переход клеток в состояние покоя [1, 2].

Одним из возможных методов определения продукции АОБ микроорганизмами является добавление реактива FastBlueBBBase непосредственно к супернатанту с последующим фотометрическимисследованием продукта реакции. Данное вещество активно реагирует с алкилоксибензолами из-за наличия у последних свободных гидроксильных OH-групп, связанных с бензольным кольцом. В этой связи важным параметром, влияющим на результат реакции, может быть выбор культуральной среды [3, 4].

Целью работы является подбор оптимальных сред культивирования микроорганизмов с целью дальнейшего определения АОБ в супернатантах.

Материалы и методы

В качестве эталонных были использованы аналоги природных АОБ – растворы метилалкилоксибензола (C₁-АОБ), гексилалкилоксибензола (C₆-АОБ) вконцентрациях: 1×10^-4 М; 5×10^-4 М; 1×10^-3 М.

Для идентификации алкилоксибензолов в культуральной жидкости был использован метод, осуществляемый путем добавления реактива FastBlueBBBase (FBB, «bioMerieux», France) к супернатанту. FBB (эмпирическая формула C₁₇H₂₀N₂O₃) представляет собой 4-амино-2,5-диэтоксибензидин, который с АОБ образует продукт с максимумом поглощения 480-500 нм и красно-коричневой окраской. Эталонные образцы в объеме 3 мл смешивались со 100 мкл рабочего раствора FBB и инкубировались в течение часа в темноте при комнатной температуре. Спектры поглощения окрашенного продукта измеряли на спектрофотометре «Флюорат – 02 Панорама» (НФП «Люмекс», Россия) в 1,0 см кюветах с использованием рабочего реактива в качестве контроля. Измерение проводили не позднее 30 минут после исхода контрольного времени, так как продукт реакции является неустойчивым и быстро окисляется.

В качестве возможных вариантов сред были предложены ГРМ-бульон (ГОСТ 20730-75), а также синтетическая среда следующего состава (мг/л) – молочная кислота – 5000; LiCl – 2200; NH₄Cl – 4000; KH₂PO₄ – 4000; микроэлементы: MgSO₄ – 50; FeSO₄ – 20; MnCl₂ – 20; ультрамикроэлементы: ZnSO₄ – 0,4; B(OH)₃ – 0,5; CuSO₄ – 0,005; факторы роста: тиамин – 40; метионин – 20; pH среды доводили раствором NaOH до 7,2–7,4. Среды смешивались с FBB и исследовались на наличие окрашивания способом, аналогичным вышеописанному.

Результаты исследования

На первом этапе мы исследовали зависимость спектров поглощения продуктов реакции FBB с алкилоксибензолами от концентрации АОБ. Оказалось, что с увеличением концентрации АОБ происходило пропорциональное усиление интенсивности окрашивания, что в большей степени было выражено в случае использования С₆-АОБ (рисунок 1).

 

Длина волны, нм

1

2

3

Оптическая плотность,

отн.ед.

Рисунок 1 – Спектры поглощения растворов С₆-АОБ после реакции с FBB (1 – 1×10^-4 М; 2 – 5×10^-4 М; 3 – 1×10^-3 М)

Кроме того, наблюдалась и прямая зависимость интенсивности окрашивания конечного продукта от длины алкильного радикала последних, что выражалось в больших величинах оптической плотности при использовании С₆-АОБ по сравнению с С₁-АОБ, достигая максимума разницы при использовании обоих веществ в концентрации 1×10^-3 М (рисунок 2).

 

Длина волны, нм

Оптическая плотность,

отн.ед.

1

2

Рисунок 2 – Спектры поглощения растворов С₁-АОБ и С₆-АОБ после реакции с FBB (1 – С₁-АОБ в концентрации 1×10^-3 М; 2 – С₆-АОБ в концентрации 1×10^-3 М)

На втором этапе мы исследовали возможность реакции FBB непосредственно с культуральной жидкостью. Были использованы ГРМ-бульон (ГОСТ 20730-75), а также синтетическая питательная среда. Оказалось, что ГРМ-бульон способен давать положительную реакцию после инкубации с FBB (ОП в максимуме поглощения составила величину, равную 0,535 отн. ед.). Это может быть связано с наличием в данной среде веществ подобных алкилоксибензолам и имеющих в своем строении свободные гидроксильные OH-группы, связанные с бензольным кольцом. В то же время, синтетическая питательная среда, имея известный состав, давала отрицательную реакцию.

Таким образом, при выборе среды культивирования для исследования появления и накопления в ней алкилоксибензолов необходимо учитывать возможную реакцию содержащихся в ней веществ с FBB. Так как FBB используют в тест-системах идентификации микроорганизмов для обнаружения продукции бактериальными клетками фосфатазы, β-галактозидазы и N-ацетил-β-глюкозаминидазы по появлению пурпурного окрашивания, можно сделать вывод о наличии подобных веществ в ГРМ-бульоне. Спектры продуктов данных реакции перекрываются со спектрами поглощения комплекса АОБ+FBB, именно поэтому использование натуральных сред может быть ограничено, необходима замена их на синтетические и/или полусинтетические питательные среды известного состава, компоненты которых не реагируют с FBB.

Список литературы:

Демкина, Е.В. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях [Текст] / Е.В. Демкина, В.С. Соина, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. – 2000. – Т. 69. – № 3. – С. 383 – 388.

Мулюкин, А.Л. Образование покоящихся форм в автолизирующихся суспензиях микроорганизмов [Текст] / А.Л. Мулюкин [и др.] // Микробиология. – 1997. – Т. 66. – № 1. – С. 42 – 49.

Мулюкин, А.Л. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора d₁ в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus [Текст] / А.Л. Мулюкин [и др.] // Микробиология. – 1996. – Т. 65. – № 1. – С. 20 – 25.

Tluscik, F. Alkylresorcinols in rye (Secale cereale L.) grains [Текст] / F. Tluscik, A. Kozubek, W. Mejbaum-Katzenellenbogen // Act. Soc. Bot. Pol. – 1981. – V. 54. – № 7. – P. 645 – 651.

Код для цитирования: Скопировать