XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

Канцерогенез является сложным патофизиологическим процессом возникновения и развития опухоли. В последние годы широкое признание получила свободно-радикальная теория канцерогенеза.

Активные формы кислорода (АФК) – это группа свободно-радикальных молекул, являющихся частично восстановленными производными кислорода, обладающих очень мощной окислительной способностью. К ним относятся: супероксидный анион-радикал (O₂^·-), перекись водорода (Н₂O₂), гидроксильный радикал (ОН^·), синглетный кислород (´O₂), гипогалоиды и другие. Зачастую они являются побочными продуктами работы дыхательной цепи - группы митохондриальных белков, утилизирующих кислород и непрерывно поставляющих клетке энергию в форме АТФ.Системы образованияАФК возникают во всех отделах клетки спонтанно или с участием ферментов. Существенный вклад в этот процесс вносит дыхательная цепь митохондрий при низкой концентрации АДФ. Важную роль играет цитохром Р-450, локализованный в эндоплазматической сети. Также АФК вырабатывается ферментами с участием NADPH в плазматической мембране фагоцитов [1].

АФК необходимы для иммунной защиты, так как усиливают синтез цитокинов и иммунных рецепторов, способствуют выходу лейкоцитов в ткани, лизируют фагоцитированные бактерии, подавляют синтез ДНК и деление клеток и могут активировать апоптоз, что предупреждает прогрессирование опухолевых процессов .

АФК, вызывая генетические мутации, играют существенную роль на всех этапах канцерогенеза. Считается, что они вызывают мутаций больше, чем алкилирующие вещества. Действие АФК заключается в повреждении хроматина, ДНК, клеточных мембран, кальциевых каналов, что вызывает нарушение поступления кальция в клетку. Наиболее реактивная форма АФК – ОН^·-радикал вызывает разрывы цепей ДНК, повреждение хромосом, что, в свою очередь, запускают механизмы повреждения и гибели клеток, а также их злокачественного перерождения. Мутации под действием АФК в половых клетках, служат источником наследуемых онкологических заболеваний. [2].

При реакции АФК с ненасыщенными жирными кислотами плазматических мембран происходит перекисное окисление липидов (ПОЛ) – свободно-радикальный процесс, постоянно протекающий в организме. В норме он поддерживается на определенном уровне.

Активация ПОЛ характерна при таком патологическом состоянии как канцерогенез, который является многоступенчатым процессом накопления мутаций и других генетических изменений, приводящих к развитию разнообразных форм рака .

При избыточной концентрации АФК повреждают клетки и способствуют развитию острых воспалительных и злокачественных процессов. Высвобождение АФК в ходе "респираторного взрыва" происходит в фагосомы и в окружающую среду, при этом бактериальные клетки теряют свою биологическую активность ,также при этом могут повреждаться сами фагоциты и здоровые нормальные ткани.

При чрезмерном накоплении АФК, пероксидов и окисленных продуктов происходит окислительный стресс, который способствует разрушению фагоцитируемого обьекта. В этом случае АФК выделяются во внешнюю среду. Это универсальный эффекторный механизм фагоцита. Окислительный стресс приводит к повреждению наиболее важных биологических молекул – нуклеиновых кислот, белков, липидов. В настоящее время окислительный стресс в организме рассматривается как универсальный неспецифический механизм инициации опухолевого роста [3].

Получая сигнал от лимфоцита, с помощью антител, взаимодействующих с Fc-рецепторами фагоцита, процесс окислительного стресса осуществляет антителозависимую цитотоксичность. Активация фагоцитов заключается в повышении проницаемости цитоплазматической мембраны и перестройке клеточного метаболизма, опосредованной повышением внутриклеточной концентрации ионов кальция, активированием аденилатциклазы и протеинкиназы С. В активированных фагоцитах значительно усиливается окисление глюкозы по апотомическому пути (пентозофосфатный цикл) и резко (в десятки раз) усиливается потребление кислорода. Последнее обстоятельство, а также внезапность и скорость, с которой возникают и развиваются эти реакции, послужили основанием для того, чтобы назвать это явление «респираторным» взрывом – одним из универсальных проявлений реактивности фагоцитирующих клеток. Основной механизм сводится к активации фагоцитов в результате контакта плазматической мембраны с опухолевой клеткой, что стимулирует активность цитоплазматического ферментного комплекса NADPH-оксидазы, который катализирует перенос электронов с NADPH на молекулярный кислород с образованием супероксидного анион-радикала [4].

NADPH-оксидаза представляет собой мультикомпонентную систему, состоящую из мембраносвязанных и цитозольных компонентов. В ее состав входят два интегральных мембранных белка, четыре цитозольных белка: р40^рhox, р47^phoх , р67^phox и гуанин-нуклеотидсвязывающий белок Rac2. Фермент локализован на мембране таким образом, что NADPH-связывающий центр направлен внутрь клетки, а супероксиданион-связывающий центр расположен на внешней стороне мембраны. В результате молекулярный кислород восстанавливается на внутренней поверхности мембраны, а супероксидный анион-радикал выделяется в среду окружающую фагоцит. Убыль NADPH по механизму обратной связи стимулирует пентозофосфатный цикл окисления глюкозы, восполняющий фонд НАДФН [5].

Сборка и активация комплекса NADPH оксидазы происходит следующим образом:

Стимуляция нейтрофила вызывает переход Rac в активную форму и фосфорилирование цитозольных компонентов p47^phox и p67^phox. Эти субъединицы транслоцируются к мембране и связываются с р22^рhox и gp91^phox, что инициирует продукцию АФК.

Субъединицы р22^рhох и gp91^рhох образуют гетеродимерный флавопротеин, известный как цитохром b₅₅₈ , который локализован в мембранах секреторных везикул и специфических гранул. Субъединица gp91^phoх является гликозилированной р-субъединицей цитохрома b₅₅₈, р22^рhох: -а-субъединицей. Стабильность каждой субъединицы флавоцитохрома b зависит от гетеродимерной формации таким образом, что мутации как gp91^phoх так и p22^phox приводят к отсутствию обоих субъединиц на клеточной поверхности.

Цитохром fe₅₅₈ содержит одну молекулу флавина и два гема, которые образуют электронно-транспортную цепь NADPH оксидазы. Экспериментально показано, что цитохром Ь₅₅₈ способен генерировать 0~₂ в отсутствии других компонентов NADPH оксидазы [5].

Белок gp91^phox рассматривается как член семейства NOX-белков, которые экспрессируются в нефагоцитирующих клетках, и имеют множество функций, не относящихся к антимикробной активности .

Цитозольный компонент p47^phox состоит из 390 аминокислот. Он содержит два SH3 мотива, один обогащенный пролином регион и один РХ домен (плекстрин-гомологичный домен). РХ-домен специфически взаимодействует с инозитолфосфатидами, в частности, с фосфатидилинозит-3,4-дифосфатом, что важно для удержания p47^phох в примембранной области. SH3 мотивы и обогащенный пролином домен также участвуют во взаимодействии с цитохромом b₅₅₈ и p67^phox. Во время активации NADPH оксидазы p47^phox связывается с цитохромом b₅₅₈, обеспечивая транслокацию цитозольного комплекса  p40^phox - p47^phox - p67^phox из цитозоля к мембране. Этот процесс не происходит без множественного фосфорилирования р47^рhох . Показано, что р47^рhох является наиболее фосфорилированной субъединицей NADPH оксидазы, имеющей 11 сайтов фосфорилирования . Известно, что p47^phox является субстратом ПКС, MAPKs, РКА, р21-активируемой киназы, ФИ-З-К для фосфорилирования in vitro . Какой из этих ферментов фосфорилирует in vivo и по какому сайту, остается неизвестным. Подобно p47^phox, p22^phox и p67^phox также фосфорилируются при активации клетки, хотя функциональная значимость фосфорилирования не известна [6].

Субъединица p67^phox состоит из 526 аминокислот, содержит два SH3 домена: пролин-обогащенный и связывающий NADPH. Белок p67^phox тесно взаимодействует с цитоскелетом и фосфорилируется во время стимуляции нейтрофила, но в меньшей степени, чем p47^phox. Эта субъединица взаимодействует с Rac2 и с цитохромом Ь₅₅₈ и регулирует каталитическую активность NADPH оксидазы через последовательность, называемую «активный домен» «Активный домен» (200-210 аминокислот) необходим для активации переноса электрона через флавоцитохром b₅₅₈ .

Субъединица p40^phox состоит из 339 аминокислот, содержит один SH3 домен и один РХ домен. Белок слабо фосфорилируется при активации клетки и не является необходимым для сборки NADPH оксидазы. Функциональная роль белка p40^phox до конца не определена, в экспериментах in vitro было показано как и его стимулирующее, так и ингибирующее действие на NADPH оксидазу. РХ домен специфично связывается с фосфатидилинозит-3-фосфатом, который накапливается в фагосомальных мембранах, что способствует удержанию NADPH оксидазного комплекса в мембране.

Структура и сборка NADPH-оксидазы показана на рисунке 1.

Рисунок-1 Структура и сборка NADPH-оксидазы.

Цитохром b, состоящий из субъединиц gp91phox (NOX2; ген CYBB) и p22phox (ген CYBA), расположен в цитоплазматической мембране и мембранах внутриклеточных гранул. После активации цитозольные компоненты p47phox (NOXО2; NCF1), р67phox (NOXA2; NCF2), р40phox (NCF4) и Rac2 (Rac2) транслоцируются к цитохрому b с образованием функциональной NADPH-оксидазы. При активации NADPH оксидазы на плазматической мембране происходит образование внеклеточных АФК, а при активации ферментного комплекса на внутренних мембранах образуются внутриклеточные фагосомальные (фАФК) и нефагосомальные АФК (нфАФК), остающиеся внутри клетки. [7].

В настоящее время ведутся исследования, направленные на возможность использования в комплексной терапии онкологических заболеваний иммунокорригирующих препаратов, проявляющих антиокислительные свойства. Так, отмечены позитивные изменения в уровне АФК под действием соединений 3d-металлов с глюконовой кислотой, способствующих повышению активности антиоксидантных ферментов [8]. Показана взаимосвязь между показателями ПОЛ, окислительной модификации белка и развитием злокачественной опухоли у мышей с индуцированной миеломой [9].

Список литературы

1. Segal A.W. How neutrophils kill microbes. Annu. Rev. Immunol. 2005; 23: 197–223.

2. Anderson K.E., Boyle K.B., Davidson K. et al. cD18-dependent activation of the neutrophil NADPH oxidase during phagocytosis of Escherichia coli or Staphylococcus aureus is regulated by class III but not class I or II PI3ks. Blood. 2008; 112: 5202–11

3. Князева О.А., Уразаева А.И. Влияние хронического стресса на развитие привитой миеломы Sp 2/0 Ag 14 у мышей BALB/c на фоне ингаляционного введения эфирных масел // Журнал научных статей Здоровье и образование в XXI веке.-2016.-Т. 18, № 4. – С. 83-87.

4. Klebanoff S.J. Myeloperoxidase friend and foe. J. Leukoc. Biol. 2005; 77: 598–625.

5 . Bokoch G.M., Zhao T. Regulation of the phagocyte NADPH oxidase by Rac GTPase. Antioxid. Redox Signal. 2006; 8: 1533–48.

6.Groemping Y., Rittinger K. Activation and assembly of the NADPH oxidase: a structural perspective. Biochem. J. 2005; 386: 401–16.

7.Н.В. Воробьева, 2013 УДК 616.155.34-092:577.152.1 Н.В. Воробьева NADPH-оксидаза нейтрофилов и заболевания, связанные с ее дисфункцией

8.2-Князева О.А., Уразаева А.И., Киреева Е.А. Анализ взаимосвязей между показателями развития миеломы и нейроиммуноэндокринной системы у мышей после проведения аэрофитотерапии // Современные проблемы науки и образования. – 2018. – № 3;

9. Князева О.А., Уразаева С.И., Конкина И.Г., Муринов Ю.И. Влияние глюконатов 3d-металлов на активность антиоксидантных ферментов и окислительные процессы in vivo при экспериментальном иммунодефиците // Медицинский Вестник Башкортостана. – 2018. - № 4.

Код для цитирования: Скопировать