Доля разрабатываемых лекарственных веществ, прошедших стадии клинических испытаний и дошедших до регистрации в качестве лекарственных средств, крайне мала, что обусловлено рядом недостатков присущих методам доклинических исследований. Причиной сложившейся ситуации явилась низкая эффективность методов выявления побочных эффектов в доклиническую стадию испытаний [1]. Все усилия, направленные на увеличение эффективности доклинических испытаний, привели к изменению методов по определению побочных эффектов лекарственных веществ: во время проведения фармакологических исследований для отбора оптимальных биологических моделей были внедрены сравнительные исследования на культурах клеток человека и лабораторных животных, позволяющие проводить экстраполяцию наблюдаемых эффектов тестируемых соединений на человека не только на основе данных, полученных в экспериментах на животных, но и в тестах, выполненных на клеточных культурах [2,3].

Центральный метаболизм большинства лекарственных препаратов,существующих на сегодняшний день, осуществляется в печени. Лекарственный метаболизм происходит в паренхиматозных клетках печени – гепатоцитах. На поверхности гепатоцитов находятся рецепторы и белки транспортёры лекарственных веществ. В микросомах гепатоцитов содержатся главные ферменты лекарственного метаболизма: цитохромы Р450, уридинглютатионтрансферазы (UGT), некоторые глютатион-S-трансферазы (GST)., флавин содержащие монооксигеназы (FMO).

В цитозолегепатоцитов растворены такие ферменты как сульфотрансферазы (SULT), N-ацетил трансферазы (NAT), некоторые GST, альдегид оксидазы (AO), ксантин оксидазы(XO). Митохондриальная мембрана гепатоцитов содержит моноамин оксидазы (MAO) [4]. Непаренхиматозные клетки печени, к которым относят синусоидальные клетки печени, биллиарныеэпиталиальные клетки, клетки Купффера, стеллатовые клетки, а также макрофаги, нейтрофилы и натуральные киллеры крови приобретают большое значение при гепатотоксическом повреждении ткани печени, но при лекарственном метаболизме выполняют второстепенную, специфичную для каждого типа клеток задачу. Оптимальный режим жизнедеятельность клеток печени обеспечивает сложно-организованная структура паренхимы печени. Структурный каркас паренхимы печени сплетён главным образом из волокон фибронектина, коллагена, фибриллин/эластина. Важно отметить, что вне структуры печени гепатоциты быстро теряют свои свойства, происходит процесс, так называемой дедифференциации, который запускается приразрушения межклеточных контактов гепатоцитов в ходе выделения из ткани печени. Исследования метаболизма лекарственных веществ (ЛВ) на клеточном уровне проводят на срезах печёночной ткани, культуре первично выделенных гепатоцитов, перевиваемых культурах клеток опухолевого и неопухолевого происхождения и гепатоцитах из плюрипотентных и стволовых клеток. Гистологические срезы и первичные гепатоцитыполучают из материала операционных вмешательств на печени. Различные линии перевиваемых клеток опухолевого происхождения выделены из гепатом человека.

Методами генной инженерии получают перевиваемые культуры гепатоцитов неопухолевого происхождения [5]. Толщина срезов (250-100 мкм) печеночной ткани ограничена доступностью питательных веществ и кислорода, для клеток внутри среза. Данная толщина среза не сохраняет минимальную структурную единицу печени – лобулу, размер которой 2 мм, но сохраняет 3-х мерный матрикс печеночной паренхимы.

Гепатоциты печёночного среза, размещённые в 3-х мерном матриксе паренхимы, длительно сохраняют активность ферментов и транспортных белков лекарственного обмена веществ, но теряют различия в спектре метаболических и анаболических функций вдоль оси лобулы [6]. После криоконсервации печёночный срез не сохраняет своих первоначальных свойств из-за разрушения межклеточных контактов гепатоцитов. Исследования динамики деградации гепатоцитов, выделенных коллагеназным методом и культивируемых в монослое на коллагене в срок до 168 часов показали, что до 24 часов экспрессия изоформ белков цитохрома Р450 существенно не изменяется. Межиндивидуальные различия гепатоцитов определяются генетическими особенностями донора гепатоцитов и внешними факторами, такими как: питание, болезни, приём лекарств, вредные привычки, пол и т.д [7]. Деградация и межиндивидуальные различия выделенных гепатоцитов человека ограничивают экстраполяцию данных исследований метаболизма лекарственных веществ. Межиндивидуальное различие считается непреодолимым недостатком при использовании среза печёночной ткани, но преодолим при работе на культуре свежевыделенных гепатоцитов человека путём сливания культур от разных доноров в один мультидонорный пул. Деградация замедляется при размещении культуры гепатоцитов в каркасе, имитирующем структуру и состав печёночной паренхимы, а также добавлением в питательную среду нужного количества ингибиторов деградации. Доказано, что наиболее точным аналогом печеночной ткани при исследованиях метаболизма лекарственных веществ на клеточном уровне является мультидонорная культура свежевыделенных или криоконсервированныхгепатоцитов человека.

Перевиваемые линии гепатоцитов человека, которые обладают рядом преимуществ, таких как доступность и стандартность являются отличной альтернативой культуре первичных гепатоцитов человека. Большинство исследователей полагают, что наиболее подходящей моделью для исследования метаболизма лекарственных веществ является линия гепатомы человека. Было проведено сравнительное исследование метаболизма лекарственных веществ в культуре свежевыделенных гепатоцитов человека, культуре гепатоцитов человека после криоконсервации и линии HepaRG после криоконсервации и показано, что различия в уровне экспрессии мРНКизоформцитохрома Р450 и уридинглютатионтрансферазы (UGT) определяли различие временного профиля метаболитов тестовых лекарственныхсоединений между культурами свежевыделенных и размороженных гепатоцитов человека с одной стороны и культурой HepaRG с другой.

Резко снижается в течение суток уровень экспрессии изоферментов цитохрома Р450 и UGT в суспензии свежих гепатоцитов, но сохраняется на приемлемом уровне в течение недели в 3-х мерной культуре. Активность ферментов лекарственного метаболизма сохраняется в культуре HepaRG в течение недели вне зависимости от способа культивирования.

Качественные и количественные различия, существующие в ферментах лекарственного метаболизма у лабораторных животных и человека обуславливают несовпадение метаболических путей биотрансформации лекарственного вещества в печени, которое является причиной видоспецифичной реакции организмов на то или иное ЛВ . Масштабные исследования причин видоспецифичностибиотрансформации ЛВ стали возможными после полного секвенирования генома человека и описания большинства белков протеома человеческой клетки. Были проведены геном-масштабные реконструкции метаболической сети человеческой клетки, исходя из накопленной информации о продуктах нескольких тысячей генов, которые, в свою очередь, послужили отправной точкой для создания геном-масштабных реконструкций метаболической сети крысы и мыши. Таким образом была реконструирована геном-масштабная модель метаболической сети крысы (Rattusnorvegicus), включающая 2324 гена и 8268 реакции, и был проведён её сравнительный анализ с геном-масштабной моделью метаболической сети человека, включающей 2315 гена и 8263 реакции. В результате обширного сравнительного анализа большинство метаболических подсистем показали нулевое видоспецифическое различие. Однако и было показано, что видоспецифичность некоторых ферментов лекарственного метаболизма является причиной, которая не всегда позволяет использовать в качестве животной модели крысу.

При исследованиях метаболизма ЛВ также используются первично выделенные гепатоциты крысы, в частности, чтобы сравнить соотношение доза-эффект (в отношении метаболических потоков лекарственного метаболизма) на уровне клетки, с соотношением доза-эффект на уровне организма. Изменение метаболических потоков лекарственного метаболизма определяют по изменению уровня экспрессии мРНК и белков или по концентрации лекарственных метаболитов в гепатоцитах, из клеточной культуры после экспозиции определённой дозы ЛВ, и гепатоцитах, выделенных из печени после введения крысе определённой дозы ЛВ. Разница в соотношении доза-эффект между гепатоцитом из культуры и гепатоцитом из печени показывает, в какой степени в биотрансформации ЛВ в организме крысы, помимо метаболизма ЛВ в гепатоцитах, задействованы другие факторы, такие как среда желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), способность всасывания из ЖКТ в кровь, взаимодействие с белками и клетками крови, характер распределения по органам и тканям, выделение почками и лёгкими и др. Определение разницы в соотношениях доза-эффект для культуральныхгепатоцитов человека и крысы, и гепатоцитов из ткани печени крысы делает возможным правильный подбор дозировок ЛВ для дальнейших более развёрнутых исследований на животных моделях. Данные, полученные при исследовании метаболизма ЛВ на клеточных культурах гепатоцитов, имеют определяющее значение при экстраполяции на организм человека, путём создания многоуровневых компьютерных моделей метаболизма лекарственных веществ на уровне организма человека .

Список литературы:

Kola, I. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?/ Ismail Kola and John Landis// Nature Reviews, Drug Discovery. – 2004. – v. 4. – p.711–715.

Bukatin M.V., Ovchinnikova O.Y., Krivitskaya A.N., Chernikov M.V., Samburov A.V., Sendrjakova V.N. Technique of the integral estimation the general condition of laboratory animals in medical and biologic experiments // Международныйжурналэкспериментальногообразования. 2010. № 6. С. 40.

Dambach,C. New Technologies and Screening Strategies for Hepatotoxicity: Use of In Vitro Models / Donna M. Dambach, Barbara A. Andrews, and Frederic Moulin// Toxicologic Pathology.–2005.–v. 33.– n.1.– p.17–26.

Roth,A. Idiosyncratic Drug-Induced Liver Injury (IDILI): Potential Mechanisms and Predictive Assays /Alexander D. Roth and Moo-Yeal Lee// BioMed Research International.–2017.– p.1–23.

Ramboer,E. Immortalized human hepatic cell lines for in vitro testing and research purposes / Eva Ramboer, Tamara Vanhaecke, Vera Rogiers, and Mathieu Vinken// Methods Mol Biol.–2015.– p.1–21.

Godoy, P. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME / Patricio Godoy, Nicola J. Hewitt, Ute Albrecht , Melvin E. Andersen, Nariman Ansari, Sudin Bhattacharya et al./ Arch Toxicol. – 2013.– 87. p. 1315–1530.

Heslop, J. Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile/ James A. Heslop, Cliff Rowe, Joanne Walsh, Rowena Sison‑Young, et al./ Arch Toxicol. – 2017.– 91. p. 439–452.