XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

При воздействии различных внешних и внутренних факторов могут изменяться морфологические и функциональные характеристики, которые обеспечивают целостность эритроцитов. Существует ряд факторов, таких как осмотические, механические, химические, температурные, к которым нормальный эритроцит способен противостоять до определенного предела. Такая способность кровяных клеток обусловлена понятием резистентности, которая в свою очередь зависит от возраста форменных элементов и может уменьшаться в ходе их старения [2]. Уменьшение резистентости эритроцитов до минимальных значений приводит к гемолизу. Гемолиз – это процесс разрушения мембран эритроцитов, сопровождающийся выходом гемоглобина в плазму крови. Плазма в таком случае будет окрашиваться в красный цвет, по другому ее называют "лаковая кровь". Гемолиз может проходить как in vivo так и in vitro [1].

Перекись водорода - одна из активных форм кислорода, которая способна вызывать гемолиз эритроцитов. Образование перекиси водорода может наблюдаться при различных процессах, таких как действие гормонов, гипероксия, инфекционные заболевания. Главными мишенями клетки являются липиды и белки мембраны эритроцита, а также внутриклеточный белковый компонент. При недостатке витамина Е и внесении перекиси водорода наблюдается перекисное окисление фосфолипидов мембраны и последующий гемолиз по коллоидно-осмотическому типу. Фракцией липидов наиболее чувствительной к окислению является фосфатидилэтаноламин [7].

Против агрессивного действия свободных радикалов перекиси водорода действует специальная антиоксидантная система. Она состоит из ферментов, которые обеспечивают защиту эритроцитарной мембраны при окислении. К таким ферментам относятся: супероксид-дисмутаза (СОД), каталаза, глутатионзависимые пероксидазы и трансферазы, удаляющие органические перекиси.

Продукты перекисного окисления могут быть как «индикаторами», так и «первичными медиаторами» стресса как особого состояния клетки, которое может привести к увеличению ее резистентности. [4]

Выработка активных форм кислорода (Н2О2) увеличивается при высвобождении из гена ионов трехвалентного железа. Такие активные формы способны приводить к прилипанию клеток крови к стенкам сосудов и вызывать окисление липопротеинов низкой плотности. В результате образуются перекиси липидов и нарушается структура и проницаемость мембраны эритроцитов. Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) играют важную роль в нормальном функционировании клетки и выступают ключевыми звеньями реакции организма на стресс [5].

Из литературных источников известно, что резистентность эритроцитов к воздействию различных факторов имеет информативный характер для оценки функционального состояния организма и его общей устойчивости к интенсивным физическим нагрузкам [1].

Содержание железа в окисленной форме соотносится с риском сердечнососудистых заболеваний, что объясняет постоянный научный интерес к изучению факторов, отвечающих за устойчивость эритроцитов к гемолизу. Особую актуальность приобретает изучение пероксидной резистентности клеток крови, так как повышенное содержание перекиси водорода в кровяном русле отмечается при различных патологических состояниях, в том числе инфекциях и воспалении [4].

Для изучения физико-химических свойств мембран клеток крови применяют метод определения перекисной резистентности эритроцитов.

Таким образом, целью нашего исследования является проведение литературного обзора изучения перекисной резистентности эритроцитов крови человека с использованием различных методик.

Исследование перекисной резистентности эритроцитов крови человека проводилось по двум методикам. Оба метода производят оценку перекисной резистентности эритроцитов на основе расчетов таких показателей как: оптическая плотность пробы, подвергшейся перекисному гемолизу; оптическая плотность, соответствующая 100 % гемолизу и оптическая плотность, характеризующая спонтанный (без Н₂О₂) гемолиз эритроцитов. Первая методика описанная В. И. Бенисовичем заключается в ингибиции эритроцитарной каталазы при помощи азида натрия для оценки резистентности мембран эритроцитов к перекисному окислению, инициированному H₂O₂. Данная методика предполагает приготовление суспензии эритроцитов, растворов перекиси водорода и азида натрия на забуференном физиологическом растворе с уровнем рН равным 7,4. Затем следует приготовление двух опытных проб путем добавления2 мл 0,068% раствора перекиси водорода к 2 мл 5% суспензии эритроцитов и 0,16 мл 0,2% раствора азида натрия. Третья проба является контрольной и предназначается дляопределения спонтанного гемолиза эритроцитов. Данную пробу получают смешиванием тех же объемов суспензии эритроцитов и раствора азида натрия, которые использовали при приготовлении двух опытных проб, но вместо раствора перекиси водорода берут равный объем забуференного физиологического раствора с pH 7,4. Инкубация проб производится в термостате в течение одного часа при 37^oC. Для получения 100% гемолиза эритроцитов к одной из опытных проб добавляют 0,2 мл 4% раствора сапонина. Центрифугирование всех проб происходит после инкубации 10 минут при 2000 об/мин. После центрифугирования происходит осаждение эритроцитов, а надосадочную жидкость используют для определения степени гемолиза. Для этого к 0,3 мл надосадочной жидкости добавляют 2,7 мл трансформирующего раствора, который дает окрашенный комплекс с Fe³⁺гемоглобина. После этого на спектрофотоколориметре определяют оптическую плотность E₅₄₁, пропорциональную количеству гемоглобина в пробе [3] .

В исследовании перекисной резистентности эритроцитов по второй методике предложенной С. С. Михайловым преследуется цель оценить общую резистентность эритроцитарных мембран, включая действие эритроцитарной каталазы, разлагающей перекись водорода. Величину перекисной резистентности определяют с учетом разбавления суспензии эритроцитов. Эритроциты дважды промывают физиологическим раствором и готовят 4,4 % суспензию. В эксперименте используется перекись водорода с исходной рабочей концентрацией 2,2 %. Такая концентрация обеспечивает удобную для измерения величину оптической плотности гемолизата (от 0,1 до 0,8). В данном методе также используются опытные и контрольная пробы. Для наиболее точного получения результата используют 10 образцов из одной и той же донорской крови. Оптическую плотность определяют на спектрофотометре при длине волны 536 нм. В кювету объемом 1 мл вносят 0,8 мл забуференного физиологического раствора (pH 7,4), добавляют 0,1 мл суспензии эритроцитов. Содержимое перемешивают [6].

По данной методике также проводится оценка перекисной устойчивости эритроцитов. Для получения результатов используются три параметра каждой пробы ("а", "б" и "в"), которые представлены ниже в формуле (1), определяются непосредственно в одной и той же спектрофотометрической кювете.

Сначала вычисляется величина "в", характеризующая спонтанный гемолиз. По данным предварительных опытов было выяснено, что в условиях описываемого определения в течение 60' спонтанный гемолиз практически пропорционален времени инкубации. Сразу же после вышеописанного перемешивания пробу в спектрофотометрической кювете центрифугируют (5', 3000 об/мин) и определяют оптическую плотность надосадочной жидкости при длине волны равной 536 нм. Затем получают E₀, т.е. нулевую точку на графике. Далее осадок взмучивают и после 30' инкубации при 37^oC снова центрифугируют и определяют оптическую плотность E₃₀. Затем по графику с учетом линейной зависимости путем экстраполяции получают E₆₀. В данном случае E₆₀ = 2 E₃₀ - E₀. Для получения значения «а» определяют оптическую плотность опытной пробы после добавления 1 мл 2,2% раствора перекиси водорода и при постоянном покачивании кюветы. После чего содержимого пробы инкубируют в течение 30' при той же температуре. Затем пробу центрифугируют (5', 3000 об/мин) и определяют оптическую плотность.

Далее в кюветы вносят стеклянную палочку, смоченную в растворе сапонина, обеспечивающего 100% гемолиз, затем пробу снова центрифугируют и определяют величину «б» путем фотометрирования.

Обработку данных проводят по формуле:

А = 100 (а - в)/(б - в), (1)

где а - величина оптической плотности опытной пробы E₅₄₁ или Е₅₃₆;

б - величина оптической плотности при полном (100%) гемолизе под влиянием сапонина;

в - величина оптической плотности контрольной пробы - характеристика спонтанного гемолиза эритроцитов в условиях опыта.

Данная формула определяет степень гемолиза А (в %) под влиянием перекиси водорода. Рассчитанная таким образом средняя перекисная резистентность эритроцитов для группы здоровых людей А = 8,9 + 1,13 [6].

По итогу проведения литературного обзора были выявлены недостатки первой методики определения перекисной устойчивости эритроцитов. Во-первых, при приготовлении проб количество эритроцитов оказывается различным во всех пробах, особенно при проведении массовых поточных определений. Соответственно оценка степени гемолиза эритроцитов в опытной пробе по отношению к пробе со 100% гемолизом сопровождается существенной ошибкой. Таким образом неоднородность суспензии эритроцитов и необходимость приготовления отдельной пробы для проведения 100% гемолиза негативно сказываются на точности метода. Во-вторых, по ходу определения устойчивости эритроцитов к перекиси водорода неоднократно приходится манипулировать малыми объемами субстрата и используемых реактивов. При измерении этих объемов создается погрешность, что также негативно сказывается на точности конечного результата. Второй представленный нами метод учитывает недостатки первого, тем самым является наиболее выгодным для применения в оценке перекисной резистентности эритроцитов. В данном способе не применяются азид натрия и трансформирующий раствор. Так как о степени гемолиза можно судить по оптической плотности E₅₃₆, которая непосредственно отражает концентрацию гемоглобина. Недостатки предыдущего метода были устранены с помощью индивидуализации каждой пробы. Суспензия эритроцитов, помещенная в спектрофотометрическую кювету, уже не покидает ее и используется сначала для определения спонтанного гемолиза, потом для определения гемолиза, вызванного добавлением H₂O₂, и, наконец, для определения полного гемолиза, обусловленного добавлением сапонина.

Учет и исправление недостатков первого метода обуславливает повышение точности полученных результатов во втором методе. Таким образом методика предложенная С. С. Михайловым является значительно упрощенной в плане использования минимального набора реактивов и экономически выгодной из-за ненадобности использования трансформирующего раствора.

Список литературы:

1 Андрийчук, А. В. Пероксидная резистентность эритроцитов и содержание маркеров окислительного стресса в крови лошадей украинской верховой породы в динамике физических нагрузок / А. В. Андрийчук, Г. М. Ткаченко, Н. Н. Кургалюк, И. В. Ткачева, Й. Грудневска, М. С. Вартовник // Научный журнал «Известия КГТУ», №36, Бишкек – 2015. – 46 с.

2 Бондарев, Л.С. Влияние некоторых воздействий на осмотическую стойкость эритроцитов./ Л. С. Бондарев, И. А. Зайцев, В. Н. Жидких // Лаб. Дело № 7, 1990. – 31 с.

3 Бенисович В. И. Образование перекисей непредельных жирных кислот в оболочке эритроцитов при болезни Маркиафа-Микели. / В. И. Бенисович, Л. И. Идельсон - Вопр. мед. химии, 1973. - N 6. - С. 596-599.

4 Кулинский, В. И. Активные формы кислорода и окислительные модификации макромолекул: польза, вред и защита / В. И. Кулинский // Соросовский образовательный журнал. 1999. №1. – 63 с.

5 Половинкина, Е. О. Окислительный стресс и особенности воздействия слабых стрессоров физической природы на перекисный гомеостаз растительной клетки: учебно-методическое пособие. / Е. О. Половинкина, Ю. В. Синицына – Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2010. – 62 с.

6 Пат. 2134420 Российская Федерация МПК G01N33/50 Способ определения перекисной резистентности эритроцитов/ Михайлов С.С; заявитель и патентообладатель Санкт-Петербургская государственная академия физической культуры им. П.Ф. Лесгафта; Михайлов С.С., Романчук Л.А., Фактор Э.А. заявл.: 09.04.97; опубл.: 10.08.99

7  Woollard K. J. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem / K. J. Woollard, S. Sturgeon, J. P. Chin-Dusting, Salem, H. H. Jackson // The Journal of Biological Chemistry. 2009. – 284 p.

Код для цитирования: Скопировать